Subclonado y Expresión de la enzima UroD wt humana, y mutantes que alteran su interfase de dimerización

MARTÍN GRAZIANO; ABEL CARCAGNO; MARÍA DEL CARMEN RÍOS DE MOLINA

Mar del Plata, Argentina

Congreso; Congreso Conjunto de Sociedades Biomédicas SAIC - SAI - SAFE - SAN - SABiología – SABiofísica – SAF; 2004

La Uroporfirinógeno decarboxilasa (UroD) es la quinta enzima de la biosíntesis del hemo. Se encuentra como homodímero en solución, pero aun se desconoce la importancia de la dimerización en su actividad. El objetivo de este trabajo es subclonar y expresar la UroD humana tanto salvaje (wt),  como mutantes con una alteración en la interfase de dimerización. Aplicamos un nuevo método para la selección de las mutantes a diseñar basado en el cálculo de la energía de interacción entre complejos proteína-proteína y del efecto de mutaciones sobre la estabilidad de dicho complejo, utilizando para ello el programa Fold-X diseñado por Serrano y col.  Comprobamos que sólo una de las 34 mutaciones puntuales clínicas (en pacientes con porfiria cutánea tarda) detectadas hasta el momento (Y311C) provoca una significativa disminución en la energía libre de unión de las subunidades, con un ΔΔGunión de 1,02 ± 0,33 Kcal/mol y 2,72 ± 0,33 Kcal/mol para el heterodimero y el homodimero respectivamente. En tanto que la mutación Q183F es una de las pocas mutantes que no afecta la estabilidad del monómero pero sí afecta significativamente la del dímero (3,97 ± 0,33 Kcal/mol). Para expresar la enzima wt se sublclonó el cDNA de humanos al plásmido de expresión pRSET. Las mutantes se generaron por mutagénesis dirigida por PCR (método overlap extension), y se comprobó su secuencia mediante secuenciación automática de los clones. Se expresaron satisfactoriamente la UroD wt, las mutantes simples  y la doble mutante Y311C,Q183F y se purificaron mediante una columna de afinidad poliHis. La purificación se siguió midiendo la actividad UroD y por SDS-PAGE, determinando PM = 45 kDa y 90 kDa. Se realizó una curva de inducción con IPTG 1mM de la UroD wt, determinando un tiempo óptimo de inducción de 4 hs. Hemos logrado diseñar y expresar la UroD salvaje y mutantes que alteran su interfase de dimerización, como paso previo para el estudio de la relación  estructura-función de la misma.