Vesículas de membrana externa de Brucella abortus modulan la respuesta macrofágica.

POLLAK CORA; DELPINO MV; BALDI PABLO

Buenos Aires, Argentina

Congreso; Asociación Argentina de Microbiología. XII Congreso Argentino de Microbiología (CAM), del 17 al 20 de octubre de 2010 en el Palais Rouge, CABA.; 2010

Asociación Argentina de Microbiología

Las variantes lisa y rugosa de Brucella liberan espontáneamente vesículas de membrana externa (VME) que contienen proteínas de membrana, LPS y otros componentes. Las VME son liberadas por diversas bacterias gram negativas y consisten en un subconjunto de la membrana externa y componentes solubles del periplasma. Este sistema de secreción extracelular participa en la estrategia utilizada por bacterias patógenas para modular la respuesta inmunológica y perjudicar la función celular del huésped. Se desconoce si factores de virulencia asociados a VME tienen efectos citotóxicos dentro de las células invadidas. La interacción de las VME de Brucella con células de mamífero y su impacto sobre la función celular no han sido abordados. Se ha demostrado que la línea macrofágica humana THP‐1 presenta una reducida producción de TNF‐α en respuesta a la infección con distintas especies del género Brucella y que existe algún factor liberado por Brucella al espacio extracelular que inhibe la expresión de TNF‐α en macrófagos humanos activados por LPS de E. coli. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es comenzar a caracterizar el efecto de las VME de BrucellaBrucella liberan espontáneamente vesículas de membrana externa (VME) que contienen proteínas de membrana, LPS y otros componentes. Las VME son liberadas por diversas bacterias gram negativas y consisten en un subconjunto de la membrana externa y componentes solubles del periplasma. Este sistema de secreción extracelular participa en la estrategia utilizada por bacterias patógenas para modular la respuesta inmunológica y perjudicar la función celular del huésped. Se desconoce si factores de virulencia asociados a VME tienen efectos citotóxicos dentro de las células invadidas. La interacción de las VME de Brucella con células de mamífero y su impacto sobre la función celular no han sido abordados. Se ha demostrado que la línea macrofágica humana THP‐1 presenta una reducida producción de TNF‐α en respuesta a la infección con distintas especies del género Brucella y que existe algún factor liberado por Brucella al espacio extracelular que inhibe la expresión de TNF‐α en macrófagos humanos activados por LPS de E. coli. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es comenzar a caracterizar el efecto de las VME de BrucellaBrucella con células de mamífero y su impacto sobre la función celular no han sido abordados. Se ha demostrado que la línea macrofágica humana THP‐1 presenta una reducida producción de TNF‐α en respuesta a la infección con distintas especies del género Brucella y que existe algún factor liberado por Brucella al espacio extracelular que inhibe la expresión de TNF‐α en macrófagos humanos activados por LPS de E. coli. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es comenzar a caracterizar el efecto de las VME de Brucella‐1 presenta una reducida producción de TNF‐α en respuesta a la infección con distintas especies del género Brucella y que existe algún factor liberado por Brucella al espacio extracelular que inhibe la expresión de TNF‐α en macrófagos humanos activados por LPS de E. coli. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es comenzar a caracterizar el efecto de las VME de Brucella‐α en respuesta a la infección con distintas especies del género Brucella y que existe algún factor liberado por Brucella al espacio extracelular que inhibe la expresión de TNF‐α en macrófagos humanos activados por LPS de E. coli. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es comenzar a caracterizar el efecto de las VME de BrucellaBrucella y que existe algún factor liberado por Brucella al espacio extracelular que inhibe la expresión de TNF‐α en macrófagos humanos activados por LPS de E. coli. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es comenzar a caracterizar el efecto de las VME de Brucella‐α en macrófagos humanos activados por LPS de E. coli. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es comenzar a caracterizar el efecto de las VME de BrucellaBrucella vinculado a la inhibición de la secreción de TNF‐α sobre macrófagos estimulados con distintos agonistas de receptores de tipo toll (TLR) (LPS, Pam3cys, flagelina). También se investigaron efectos similares sobre otros tipos celulares que pueden ser infectados por Brucella (células bronquiales humanas). Las VME fueron obtenidas a partir de la concentración del medio de cultivo en el que crecieron bacterias B. abortus S2308. Luego se les cuantificaron proteínas por el método de Bradford. Las VME fueron analizadas por SDS‐PAGE y western blot revelado con anticuerpos contra LPS de Brucella y además visualizadas por microscopía electrónica. Los ensayos de inhibición de la secreción de citoquinas fueron realizados mediante la co‐incubación de las células (línea monocítica humana THP‐1 y bronquial humana Calu‐6) con diferentes concentraciones de VME durante 4 horas, seguido de un lavado y un estímulo de la secreción de 24 horas de duración con LPS de E. coli (agonista de TLR‐4), Pam3cys (agonista de TLR‐2) o Flagelina (agonista de TLR‐5). La cuantificación de las citoquinas secretadas fue realizada por ELISAs comerciales. De acuerdo a la observación de las VME a través de microscopía electrónica, se calcularon los diámetros de las vesículas, siendo las más pequeñas de 30 nm y las más grandes de 178 nm, lo cual concuerda con lo reportado en bibliografía. Por western blot se detectó la presencia de LPS de Brucella.‐α sobre macrófagos estimulados con distintos agonistas de receptores de tipo toll (TLR) (LPS, Pam3cys, flagelina). También se investigaron efectos similares sobre otros tipos celulares que pueden ser infectados por Brucella (células bronquiales humanas). Las VME fueron obtenidas a partir de la concentración del medio de cultivo en el que crecieron bacterias B. abortus S2308. Luego se les cuantificaron proteínas por el método de Bradford. Las VME fueron analizadas por SDS‐PAGE y western blot revelado con anticuerpos contra LPS de Brucella y además visualizadas por microscopía electrónica. Los ensayos de inhibición de la secreción de citoquinas fueron realizados mediante la co‐incubación de las células (línea monocítica humana THP‐1 y bronquial humana Calu‐6) con diferentes concentraciones de VME durante 4 horas, seguido de un lavado y un estímulo de la secreción de 24 horas de duración con LPS de E. coli (agonista de TLR‐4), Pam3cys (agonista de TLR‐2) o Flagelina (agonista de TLR‐5). La cuantificación de las citoquinas secretadas fue realizada por ELISAs comerciales. De acuerdo a la observación de las VME a través de microscopía electrónica, se calcularon los diámetros de las vesículas, siendo las más pequeñas de 30 nm y las más grandes de 178 nm, lo cual concuerda con lo reportado en bibliografía. Por western blot se detectó la presencia de LPS de Brucella.Brucella (células bronquiales humanas). Las VME fueron obtenidas a partir de la concentración del medio de cultivo en el que crecieron bacterias B. abortus S2308. Luego se les cuantificaron proteínas por el método de Bradford. Las VME fueron analizadas por SDS‐PAGE y western blot revelado con anticuerpos contra LPS de Brucella y además visualizadas por microscopía electrónica. Los ensayos de inhibición de la secreción de citoquinas fueron realizados mediante la co‐incubación de las células (línea monocítica humana THP‐1 y bronquial humana Calu‐6) con diferentes concentraciones de VME durante 4 horas, seguido de un lavado y un estímulo de la secreción de 24 horas de duración con LPS de E. coli (agonista de TLR‐4), Pam3cys (agonista de TLR‐2) o Flagelina (agonista de TLR‐5). La cuantificación de las citoquinas secretadas fue realizada por ELISAs comerciales. De acuerdo a la observación de las VME a través de microscopía electrónica, se calcularon los diámetros de las vesículas, siendo las más pequeñas de 30 nm y las más grandes de 178 nm, lo cual concuerda con lo reportado en bibliografía. Por western blot se detectó la presencia de LPS de Brucella.B. abortus S2308. Luego se les cuantificaron proteínas por el método de Bradford. Las VME fueron analizadas por SDS‐PAGE y western blot revelado con anticuerpos contra LPS de Brucella y además visualizadas por microscopía electrónica. Los ensayos de inhibición de la secreción de citoquinas fueron realizados mediante la co‐incubación de las células (línea monocítica humana THP‐1 y bronquial humana Calu‐6) con diferentes concentraciones de VME durante 4 horas, seguido de un lavado y un estímulo de la secreción de 24 horas de duración con LPS de E. coli (agonista de TLR‐4), Pam3cys (agonista de TLR‐2) o Flagelina (agonista de TLR‐5). La cuantificación de las citoquinas secretadas fue realizada por ELISAs comerciales. De acuerdo a la observación de las VME a través de microscopía electrónica, se calcularon los diámetros de las vesículas, siendo las más pequeñas de 30 nm y las más grandes de 178 nm, lo cual concuerda con lo reportado en bibliografía. Por western blot se detectó la presencia de LPS de Brucella.‐PAGE y western blot revelado con anticuerpos contra LPS de Brucella y además visualizadas por microscopía electrónica. Los ensayos de inhibición de la secreción de citoquinas fueron realizados mediante la co‐incubación de las células (línea monocítica humana THP‐1 y bronquial humana Calu‐6) con diferentes concentraciones de VME durante 4 horas, seguido de un lavado y un estímulo de la secreción de 24 horas de duración con LPS de E. coli (agonista de TLR‐4), Pam3cys (agonista de TLR‐2) o Flagelina (agonista de TLR‐5). La cuantificación de las citoquinas secretadas fue realizada por ELISAs comerciales. De acuerdo a la observación de las VME a través de microscopía electrónica, se calcularon los diámetros de las vesículas, siendo las más pequeñas de 30 nm y las más grandes de 178 nm, lo cual concuerda con lo reportado en bibliografía. Por western blot se detectó la presencia de LPS de Brucella.Brucella y además visualizadas por microscopía electrónica. Los ensayos de inhibición de la secreción de citoquinas fueron realizados mediante la co‐incubación de las células (línea monocítica humana THP‐1 y bronquial humana Calu‐6) con diferentes concentraciones de VME durante 4 horas, seguido de un lavado y un estímulo de la secreción de 24 horas de duración con LPS de E. coli (agonista de TLR‐4), Pam3cys (agonista de TLR‐2) o Flagelina (agonista de TLR‐5). La cuantificación de las citoquinas secretadas fue realizada por ELISAs comerciales. De acuerdo a la observación de las VME a través de microscopía electrónica, se calcularon los diámetros de las vesículas, siendo las más pequeñas de 30 nm y las más grandes de 178 nm, lo cual concuerda con lo reportado en bibliografía. Por western blot se detectó la presencia de LPS de Brucella.‐incubación de las células (línea monocítica humana THP‐1 y bronquial humana Calu‐6) con diferentes concentraciones de VME durante 4 horas, seguido de un lavado y un estímulo de la secreción de 24 horas de duración con LPS de E. coli (agonista de TLR‐4), Pam3cys (agonista de TLR‐2) o Flagelina (agonista de TLR‐5). La cuantificación de las citoquinas secretadas fue realizada por ELISAs comerciales. De acuerdo a la observación de las VME a través de microscopía electrónica, se calcularon los diámetros de las vesículas, siendo las más pequeñas de 30 nm y las más grandes de 178 nm, lo cual concuerda con lo reportado en bibliografía. Por western blot se detectó la presencia de LPS de Brucella.‐1 y bronquial humana Calu‐6) con diferentes concentraciones de VME durante 4 horas, seguido de un lavado y un estímulo de la secreción de 24 horas de duración con LPS de E. coli (agonista de TLR‐4), Pam3cys (agonista de TLR‐2) o Flagelina (agonista de TLR‐5). La cuantificación de las citoquinas secretadas fue realizada por ELISAs comerciales. De acuerdo a la observación de las VME a través de microscopía electrónica, se calcularon los diámetros de las vesículas, siendo las más pequeñas de 30 nm y las más grandes de 178 nm, lo cual concuerda con lo reportado en bibliografía. Por western blot se detectó la presencia de LPS de Brucella.E. coli (agonista de TLR‐4), Pam3cys (agonista de TLR‐2) o Flagelina (agonista de TLR‐5). La cuantificación de las citoquinas secretadas fue realizada por ELISAs comerciales. De acuerdo a la observación de las VME a través de microscopía electrónica, se calcularon los diámetros de las vesículas, siendo las más pequeñas de 30 nm y las más grandes de 178 nm, lo cual concuerda con lo reportado en bibliografía. Por western blot se detectó la presencia de LPS de Brucella.‐5). La cuantificación de las citoquinas secretadas fue realizada por ELISAs comerciales. De acuerdo a la observación de las VME a través de microscopía electrónica, se calcularon los diámetros de las vesículas, siendo las más pequeñas de 30 nm y las más grandes de 178 nm, lo cual concuerda con lo reportado en bibliografía. Por western blot se detectó la presencia de LPS de Brucella.Brucella. La preincubación con 10 μg/ml de VME de Brucella inhibió en un 91, 95 y 74 % la secreción de TNF‐α en la línea macrofágica humana THP‐1 frente a los estímulos de LPS, Pam3cys y Flagelina respectivamente y disminuyó levemente la de IL‐8 en la línea bronquial humana Calu‐Brucella inhibió en un 91, 95 y 74 % la secreción de TNF‐α en la línea macrofágica humana THP‐1 frente a los estímulos de LPS, Pam3cys y Flagelina respectivamente y disminuyó levemente la de IL‐8 en la línea bronquial humana Calu‐‐α en la línea macrofágica humana THP‐1 frente a los estímulos de LPS, Pam3cys y Flagelina respectivamente y disminuyó levemente la de IL‐8 en la línea bronquial humana Calu‐‐8 en la línea bronquial humana Calu‐ 6 aunque en esta última las diferencias no alcanzaron significación estadística. Las VME de Brucella reducen la secreción de TNF‐α inducida por agonistas de TLR en macrófagos humanos.Brucella reducen la secreción de TNF‐α inducida por agonistas de TLR en macrófagos humanos.