Sistemas fotoinducidos de reparación de ADN en bacterias extremófilas de Lagunas De Altura Puno-Andinas

ALBARRACÍN V.H.

Córdoba

Encuentro; Segundo Encuentro de Fotobiólogos Moleculares Argentinos; 2013

Grupo Argentino de Fotobiológos Moleculares

De una colección de 500 microorganismos extremófilos aislados de las Lagunas de Altura Puno Andinas (LAPAs) se obtuvieron los genomas de tres cepas modelo: Acinetobacter sp. Ver3, Exiguobacterium sp. S17 y Nesterenkonia sp. Act20 consideradas politextremófilas, ya que resisten múltiples factores extremos (Albarracin et al., 2012; Belfiore et al, 2013; Farias et al., 2013). El minado de los mismos reveló la existencia de varios genes codificantes de fotorreceptores en entornos genómicos diferentes a cepas del mismo género que no viven en condiciones extremas, indicando que los mismos pueden tener un papel fundamental en la respuesta adaptativa en su ambiente de origen, intensamente irradiado por luz, incluso en el rango del UV-B. Se puso especial atención en los fotorreceptores pertenecientes a la familia de las fotoliasas-criptocromos (PL-Cry). En Ver3, Act20 y S17 se encontraron secuencias codificantes para fotoliasas CPD-Clase I y para la nueva clase de criptocromos llamadas Cry-Pro. Los Cry-DASH fueron encontrados sólo en Exiguobacterium. Nesterenkonia sp. Act20, presentó un tipo adicional de fotoliasas con homología a las CPD-Clase III. Posteriormente, se trabajó más específicamente con la fotoliasa (Ver3Phr) de Acinetobacter sp. Ver3, puesto que esta cepa demostró un alta resistencia a UV asociada a una eficiente capacidad de fotorreparación (Albarracín et al., 2012). De acuerdo a estudios filogenéticos, de comparación de secuencia con la fotoliasa CPD-Clase I de Escherichia coli (EcPhr) y de modelado por homología estructural, confirmamos que Ver3Phr correspondería a una PL CPD-Clase I. El gen correspondiente fue clonado y sobreexpresado, tras lo cual se realizaron estudios funcionales del mismo para caracterizar el fotorreceptor tanto por métodos espectroscópicos (absorbancia, fluorescencia) como analíticos (HPLC). La capacidad de fotorreparación de la fotoliasa recombinante fue confirmada in vivo por experimentos de complementación cuando el gen codificante de Ver3Phr fue clonado en vectores pQE60 e incorporado por transformación a una cepa E. coli (KY1225) con mutaciones deletéreas para los genes RecA y EcPhr, y por lo tanto deficiente en fotorreparación del daño a ADN y en reparación de daño en la oscuridad. Los transformantes que llevaban el pQE60-Ver3Phr o los controles sin plásmido fueron irradiados con UV-B. Ambos tipos de celulas se inocularon en placas inmediatamente después del tratamiento no presentando supervivientes luego de 24 h de incubación en la oscuridad. Sin embargo, si las células irradiadas se fotorreparaban durante 120 minutos antes de la incubación, las células transformadas alcanzaban casi los mismos números de UFC que las células no tratadas con UV (ca. un orden de magnitud menos) mientras que las células no-transformadas no lograron recuperarse. Estos resultados indican que la proteína codificada por el gen phr de Acinetobacter sp. Ver3 efectivamente presenta actividad de fotorreactivación, pero a diferencia de su homólogo EcPhr (la fotoliasa de E. coli), su contribución a la reparación en la oscuridad es nula. Los resultados expuestos indican que los extremófilos de las LAPAs son fuentes importantes de moléculas noveles de importancia biotecnológica que, por otro lado, podrían convertirse en moléculas modelos (?extremoenzimas?) para estudiar y entender determinados mecanismos fotoinducidos en proteínas fotorreceptoras.