CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

Luego de una dosis oral de monfluorofosfato, una fracción es absorbida luego de su hidrólisis por la fosfatasa alcalina intestinal. Experimentos realizados en nuestro laboratorio demostraron que el calcio: 1) disminuye la actividad de la fosfatasa alcalina. 2) se fija a la enzima por dos mecanismos, produciendo cambios de su actividad enzimática.El objetivo de este trabajo fue determinar cambios estructurales asociados a la unión al calcio. Se realizaron tres tipos de experimentos. Soluciones conteniendo la misma cantidad de fosfatasa alcalina purificada: 1) se incubaron con concentraciones de calcio (0-100 mM) en presencia de 45Ca (n=20). Mediante ultrafiltración se determinó la cinética de fijación. La concentración de calcio fijado ([Ca++]f) se ajustó a una función exponencial de la concentración de calcio total ([Ca++]T), [Ca++]f = K1*(1-e-K2*[ca++]T), donde K1 y K2 son constantes del proceso. 2) (20 ul) en presencia o en ausencia de [Ca++]=50 mM, se cromatografiaron sobre Sephadex G100. Se determinó el volumen de elución de la enzima: Volumen elución, con [Ca++]= 0mM: 6,2±0,4 ml (n=3), con [Ca++]= 50 mM: 5,1±0,2 ml (n=3), p<0,05. 3) incubadas con [Ca++]= 0-100 mM y 45Ca se analizaron en geles de poliacrilamida al 7%. Se determinó radioactividad (cpm) en la región del gel correspondiente al peso molecular de la enzima. Las cpm para las soluciones con [Ca++]= 0, 1, 10, 20, 50 y 100 mM fueron: 45±2, 62±43, 91±28, 162±5, 123±29, 47±49 respectivamente. Se concluye: 1- la cantidad de calcio fijado a la fosfatasa alcalina sigue una función exponencial de la [Ca++] Total del buffer. 2- Cuando se supera una concentración de calcio en el buffer de incubación de 10-20 mM se modifica el peso molecular aparente determinado por cromatografía de tamiz molecular y electroforesis en gel de poliacrilamida.

enviar mensaje