Detección de fosfatasa alcalina intestinal de rata en electroforesis en geles de poliacrilamida

BRUN, LUCAS RICARDO MARTÍN; RIGALLI, ALFREDO; PUCHE, RODOLFO

Rosario

Congreso; XI Congreso Científico Argentino de Estudiantes de Medicina; 2000

Asociación Científica Rosarina de Estudiantes de Medicina

La fosfatasa alcalina intestinal (PA) hidroliza el monofluorfosfato de sodio (MFP) administrado por vía oral. Para el estudio del mecanismo de acción , se requiere  PA de alta pureza demostrada por  homogeneidad en PAGE. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método de identificación de  PA utilizando la actividad de la misma y la formación de compuestos coloreados de sus productos de hidrólisis con metales divalentes.  Se escogió como sustrato el ß-glicerofosfato de sodio (ßGP) y nitrato de cobalto [Co(II)] como catión que reaccionará con el fosfato formando un precipitado violeta. 1) Se demostró que el ßGP es hidrolizado por la PA in vitro, generando un precipitado violeta de Co3(PO4)2, en presencia de Co(II). 2) Para la realización de PAGE, la PA se debe mezclar con un buffer específico (BS) y calentar a 100° para su desnaturalización. Se determinó la actividad  (pmol pNFF/seg.L ) de la PA en presencia de BS a 100° C= 0.086±0.009 y 25°C= 12,94±0.01, p<0.001, n=4. 3) La presencia de PA en PAGE fue demostrada incubando el gel  en una mezcla de ßGP 1M y + Co(II) 1M a pH=7,8, en una zona de 180Kda. La banda correspondiente a PA no se demostró en muestras sin PA o cuando el gel se fijó con metanol-acético. Conclusiones: 1- La muestra con BS no debe tener tratamiento térmico. 2- No se debe hacer fijación con metanol. 3- El ßGP + Co(II) son reactivos específico para identificar la zona de migración de la PA.