INVESTIGADORES
BRUN Lucas Ricardo Martin
congresos y reuniones científicas
Título:
Efecto del calcio sobre la fosfatasa alcalina intestinal del borde en cepillo de la rata in vivo.
Autor/es:
BRANCE, MARÍA LORENA; BRUN, LUCAS RICARDO MARTÍN; DE CANDIA, LUCAS FERNANDO; RIGALLI, ALFREDO; PUCHE, RODOLFO
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Congreso; XXII Reunión Anual de la Asociación Argentina de Osteología y Metabolismo Mineral; 2005
Institución organizadora:
Asociación Argentina de Osteología y Metabolismo Mineral
Resumen:
La fosfatasa alcalina intestinal (FAI) liga cationes calcio (Ca++), fenómeno que produce inhibición no competitiva de su actividad enzimática. Este efecto depende de la concentración de Ca++ y ha sido demostrado in vitro, con enzima purificada. Dicha inhibición en presencia de Ca++ 50 mM se acompaña de aumento del peso molecular de la enzima y unión de cationes a la enzima. El objetivo de este trabajo fue investigar el efecto del Ca++ in vivo sobre la actividad y la expresión de la FAI de la rata. Se utilizaron ratas IIM/FcM sublínea “m” adultas de 200 g. Se aisló una porción del intestino mediante una ligadura a nivel del píloro y otra a 10 cm en sentido caudal en la que se colocó un catéter, para introducir la solución a investigar y extraer muestras del contenido duodenal. En cada animal del grupo tratado (n=4) se colocaron 2 ml de una solución conteniendo glucosa 160 mM, CaCl2 50 mM, 4 mCi de 45Ca++, Tris 25 mM, pH 7  y el grupo control (n=4) recibió 2 ml de la misma solución en ausencia de CaCl2. Se extrajeron muestras de  la solución de la luz intestinal cada 10 minutos durante 80 minutos y se determinó la concentración de Ca++ a través de la medida de 45Ca++ en la luz intestinal utilizando un contador de centelleo líquido. En cada uno de los tiempos mencionados se extrajo una porción de 0,5 cm de intestino, se procesaron por técnicas histológicas convencionales y se realizaron mediciones histoquímica de actividad fosfatásica por incubación del preparado histológico con 5-Br-4-Cl-3-indolil fosfato e inmunohistoquímica para cuantificar la enzima presente en el borde en cepillo empleando un anticuerpo de cobayo anti-FAI de rata, anticuerpo anti-IgG de cobayo conjugado con peroxidasa y 3-amin-9-etilcarbazol como sustrato. La actividad y la cantidad de enzima del ribete en cepillo se determinó sobre imágenes digitales y se expresó como densidad óptica integrada. Con el fin de comprobar el efecto del calcio sobre la actividad enzimática, cortes histológicos de las ratas controles fueron incubados en CaCl2 50 mM y cortes de ratas tratadas con Ca++ 50 mM, fueron expuestos a EDTA 0,5 M. En ambos tratamientos se determinó la expresión de la enzima como se detalló anteriormente. La actividad de la enzima en el borde en cepillo en ausencia de Ca++  disminuye en función del tiempo, mientras que en presencia de calcio se mantiene por encima del grupo control durante el tiempo que la concentración de calcio luminal supera 25 mM. El tratamiento con calcio de cortes histológicos controles restaura el valor de actividad enzimática y la exposición al EDTA de los cortes del grupo tratado con calcio, disminuye la actividad a valores que no discrepan de cero. La expresión de la enzima en la membrana no difirió entre los grupos a los diferentes tiempos. La absorción del Ca++ se ajustó significativamente a un modelo biexponencial (r= 0.903) y presentó una cinética rápida para [Ca++]>25 mM y lenta para [Ca++]<25 mM. Conclusiones: 1- La actividad de la enzima del borde en cepillo es dependiente de la concentración de calcio luminal. 2- La actividad enzimática de la enzima del ribete en cepillo se mantiene elevada mientras la concentración de calcio es mayor a 25 mM. 3- La disminución de la actividad enzimática observada en el grupo control no se debe a una disminución de la expresión de la enzima. El cambio simultáneo de elevada actividad enzimática de FAI y cinética de absorción de calcio rápida a baja actividad y cinética de absorción de calcio lenta, cuando la concentración de Ca++ desciende por debajo de 25 mM, sugieren que la FAI podría estar actuando en algún mecanismo de transporte de calcio, proveyendo simultáneamente fosfato y calcio al proceso de absorción.