Unión del catión calcio a la fosfatasa alcalina intestinal de la rata. Modificación de la ciné-tica enzimática y su estructura molecular.

BRUN LR; BRANCE ML; RIGALLI A; PUCHE RC

Buenos Aires

Congreso; XXII Reunión Anual de la Asociación Argentina de Osteología y Metabolismo Mineral; 2005

Asociación Argentina de Osteología y Metabolismo Mineral

La fosfatasa alcalina intestinal (FAI) es una fosfomonoesterasa que actúa sobre una gran variedad de moléculas fosforiladas. Su rol en la absorción intestinal de calcio (Ca2+) es parcialmente conocido. Hemos demostrado que la FAI es inhibida en forma no competitiva por el Ca2+ y que cuando la concentración Ca2+ es menor a 10 mM la enzima liga 7.8±4.4 iones Ca2+ mol de FAI con una constante de afinidad de 19.1±8.4 mM-1, siendo los sitios independientes y de igual afinidad. Si la concentración de Ca2+ es mayor a 20 mM el mencionado modelo no es aplicable y la enzima fija 6300±1300 iones/mol de proteína. La medida de actividad de FAI en solución muestra un efecto bifásico dependiendo de la concentración de calcio investigada. Cuando la [Ca2+]>10 mM la actividad de FAI se incrementa en función de la concentración de Ca2+ (r= 0.95 p20 mM dicha relación se invierte (r= -0.70 p50 mM. En todos los experimentos se utilizó FAI purificada del intestino de ratas línea IIM/FcM sublínea ?m? adultas. La enzima fue incubada con Ca2+ >50 mM durante 5 minutos en los casos requeridos. Se realizaron electroforesis en geles de poliacrilamida al 5% con SDS (SDS-PAGE) y cromatografía de exclusión molecular con la enzima en presencia y ausencia de Ca2+ >50 mM. Para los Western blots y dot blots se utilizó un anticuerpo de cobayo anti-FAI de rata, anti-IgG de cobayo conjugado con peroxidasa y 3-amin-9-etilcarbazol (AEC) como sustrato. En solución, la actividad de FAI se determinó utilizando como sustrato p-nitrofenilfosfato. En membranas de nitrocelulosa la actividad de FAI se detectó utilizando 5-Br-4-Cl-3-indolil fosfato (BCIP). Se realizaron los siguientes experimentos: 1- SDS-PAGE en presencia de 45Ca2+: Se detectaron dos bandas con radioactividad. Una de bajo y otra de alto peso molecular. El tratamiento con Ca2+ >50 mM produjo un incremento de la radioactividad asociada a la banda de alto peso molecular. 2- Cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G200 de FAI en presencia y ausencia de Ca2+ 50 mM: En ambos casos se detectaron por Dot blot dos fracciones (F) de FAI con diferente  masa molecular: F1= 161±17 kDa y F2= 472±25 kDa. F1 presenta mayor actividad específica que F2. El tratamiento con Ca2+ produce disminución de la cantidad de proteína de F1 y un proporcional incremento de F2. 3- Western Blot: Se detectaron dos fracciones de la enzima: F1 con actividad enzimática y F2 sin actividad. El peso molecular de las fracciones fue: F1= 168±6 kDa y F2= 425±45 kDa. Se concluye que el tratamiento de la FAI con calcio 50 mM produce agregación molecular acompañada de disminución de la actividad específica de la enzima. La importancia que la agregación molecular de la FAI simultánea con la fijación de calcio pueda tener sobre el mecanismo de absorción del catión a nivel intestinal es desconocido y requiere experimentos adicionales.