Estudio de la interacción calcio-fosfatasa alcalina intestinal de la rata y su relación con la actividad enzimática

RIGALLI A; BRUN LR; PUCHE RC

Buenos Aires

Congreso; XVIII Reunión Anual de la Asociación de Osteología y Metabolismo Mineral (AAOMM); 2001

Asociación de Osteología y Metabolismo Mineral (AAOMM)

La fosfatasa alcalina (PA) es una enzima presente en el intestino que participa en el proceso de absorción del monofluorofosfato (MFP) al producir su hidrólisis a fluoruro y fosfato. Trabajos previos realizados en nuestro laboratorio demostraron que el Calcio (Ca) en concentración 50 mM produce inhibición anticompetitiva de la enzima, tanto con el MFP como con p-nitrofenilfosfato (pNFF) como sustratos. El objetivo de este trabajo fue definir la interacción Ca-PA : determinar el número de sitios de fijacion (n) de calcio por molécula de enzima, su constante de afinidad (k) y la relación de los mismos con la actividad enzimática. Se realizaron incubaciones de cantidades constantes de PA purificada del intestino de la rata, con diferentes concentraciones de calcio [Ca]= 0 - 100 mM en presencia de 45Ca. Utilizando la técnica de ultrafiltración con membranas de límite de filtracion 30 kDa se determinó el calcio libre y ligado a la PA. Con el procedimiento de Scatchard se caracterizó el tipo de de interacción entre el catión y la enzima. Con concentraciones de Ca menores a 10 mM se obtuvo n = 8 y K= 18 mM-1, ajustandose a un modelo de "n" sitios independientes de igual afinidad. Con [Ca] mayor a 10 mM el proceso no se ajusta al modelo mencionado. En dos experimentos aparte se determinó actividad de fosfatasa alcalina: frente al pNFF y en geles de poliacrilamida utilizando el mismo rango de concentraciones de Calcio que en el experimento anterior. Se correlacionó la actividad de fosfatasa alcalina frente al pNFF con [Ca] < 10 mM: r = 0,999 y con [Ca] > 10 mM: r = -0,945. La actividad medida en gel de poliacrilamida mostró resultados similares a los obtenidos con pNFF en ensayos convencionales [Ca]10 mM: r = -0,948. Se concluye que el calcio interacciona con fosfatasa alcalina de dos maneras diferentes. A concentraciones de calcio menores a 10 mM, el calcio se liga siguiendo un modelo reversible con sitios de igual afinidad, produciendo aumento de la actividad enzimática. Con concentraciones de calcio mayores a 10 mM la interacción no es compatible con un modelo reversible y produce disminución de la actividad enzimática.