?Alteraciones en el regulador mepR y aumento de la expresión de la bomba de eflujo MepA en S. aureus resistentes a tigeciclina

HERRERA M; DI GREGORIO S; FERNÁNDEZ S; POSSE G.; MOLLERACH M; DI CONZA J

Paraná

Jornada; 5tas Jornadas de Investigación de la Universidad Adventista del Plata.; 2016

Universidad Adventista del Plata

Introducción: MepR actúa como represor de la expresión de la bomba de eflujo MepA involucrada en la expulsión de tigeciclina en Staphylococcus aureus. La alteración en este regulador podría llevar a un incremento en la expresión de la bomba MepA, dando lugar al desarrollo de resistencia.Objetivos: El objetivo de este estudio fue detectar mutaciones en el regulador MepR y evaluar el nivel de expresión del gen que codifica para la bomba de eflujo MepA en mutantes de S. aureus resistentes a tigeciclina seleccionados in vitro.Materiales y métodos: Se estudiaron 12 aislamientos clínicos de S. aureus (sensibles y resistentes a la meticilina) y sus respectivos mutantes resistentes a tigeciclina seleccionados in vitro (SARTm). Los valores de CIM de tigeciclina en los SARTm disminuyeron al menos 4 veces cuando se la combinó con reserpina 20 µg/ml. El gen mepR fue amplificado por PCR y secuenciado. El análisis comparativo in silico se realizó mediante diferentes herramientas bioinformáticas. La expresión del gen mepA se evaluó mediante RT-qPCR, comparándola con sus respectivos aislamientos parentales. Los datos fueron expresados como cantidades relativas normalizadas (NRQ) usando gyrB y pta como genes de referencia. Los ensayos fueron realizados por triplicado. El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo usando el test de Student (α = 0,05).Resultados: Las secuencias de nucleótidos de mepR en todos los aislamientos SARTm mostraron diversas alteraciones con respecto a los aislamientos parentales. En 9/12 SARTm se observaron sustituciones de nucleótidos. En 5 de ellos se produjeron cambios de aminoácidos en distintas posiciones de la proteína MepR, mientras que en 4 se generó un codón de terminación prematuro. Por otra parte, en 2/12 SARTm se detectaron deleciones en la secuencia de mepR. En uno de ellos la deleción de un nucleótido dio lugar a una sustitución de aminoácidos y a la aparición de un codón de stop, mientras que en el otro la deleción observada fue de 71 pares de bases y dio lugar a la pérdida de 23 aminoácidos. Por último, en 1/12 SARTm se detectó una duplicación de un fragmento de 12 pares de bases, que dio lugar a una adición de 4 aminoácidos en la secuencia de MepR.En dos de los SARTm que mostraron diferentes mutaciones en MepR (una mutación sin sentido, y una por cambio de sentido) se evaluó la expresión del gen mepA. Los valores de NRQ en los dos SARTm analizados fueron significativamente mayores que en sus respectivos aislamientos parentales (p < 0,0001 y p = 0,0009) indicando un aumento en la expresión de gen que codifica para esta bomba de eflujo en los SARTm. Conclusiones: Este estudio pone en evidencia alteraciones en el regulador MepR en SARTm que podrían afectar la función represora sobre el gen mepA con el consecuente incremento de la expulsión intracelular de tigeciclina y el desarrollo de la resistencia a esta droga en las cepas estudiadas.