CTX M-2 en Escherichia coli

RADICE M; POWER P; MOLLERACH M; DONGARRÁ S; GUTKIND G

Buenos Aires

Congreso; VIII Congreso Argentino de Microbiología.; 1998

Asociación Argentina de Microbiología

En nuestro país los niveles de resistencia a cefalosporinas de tercera generación se han incrementado notoriamente en los últimos años, contribuyendo a este incremento la diseminación de ß-lactamasas de espectro extendido (BLEE). En el presente trabajo se analizaron los mecanismos de resistencia a dichas drogas en doce cepas de Escherichia coli provenientes del Hospital Nacional de Pediatría. En una primera etapa se determinó la susceptibilidad a distintos antibióticos por el método de dilución en medio sólido según recomendaciones de la NCCLS. En base a los datos obtenidos fue posible distinguir dos grupos de microorganismos, un grupo de 5 cepas con valores de concentración inhibitoria mínima (CIM) para cefotaxima (CTX) de 4 mg/ml y las restantes 7 cepas presentaron valores de CIM para CTX entre 32 y 128 mg/ml. A partir de cultivos en fase estacionaria de las cepas en estudio se obtuvieron los extractos enzimáticos crudos, los cuales fueron sometidos a isoelectroenfoque. En el primer grupo de microorganismos, se detectó la presencia de una única enzima de pI 5,4 activa frente a ampicilina (100 mg/ml) cuando este sustrato fue utilizado en el método de revelado iodométrico. En el segundo grupo se detectaron dos enzimas, una de pI 5,4 y una de pI 8,2, activas frente a ampicilina (100 mg/ml) y la segunda activa también frente a ceftriaxona (1000 mg/ml). Estas enzimas, presentes en las cepas altamente resistentes a CTX fueron separadas y parcialmente purificadas por cromatografía de exclusión molecular y de intercambio iónico. La enzima de mayor pI fue caracterizada por su velocidad relativa de hidrólisis y su Km para distintos antibióticos ß-lactámicos por método espectrofotométrico, indicando una eficientemente hidrólisis y CTX, así como también cefalosporinas de primera y cuarta generación y penicilinas, no así de ceftacidima. Los valores de 150 para sulbactama y ácido clavulánico, indicaron que esta enzima es completamente inhibible, en especial por el segundo de dichos inhibidores, no detectándose diferencias cuando el ensayo fue realizado con previa incubación de la enzima con el inhibidor. Mediante SDS PAGE y posterior renaturalización se estimó el PM de esta enzima en aproximadamente 29 kDa. Las cepas pertenecientes al segundo grupo, presentaron un plásmido de más de 40 kDa, el que fue transferido a Escherichia coli CGA por conjugación. Tanto los transformantes obtenidos, como los transconjugantes, resultaron resistentes a CTX. Empleando cebadores diseñados a partir de la secuencia de CTX M-2 se logró amplificar un fragmento de 1 kb, el que fue completamente secuenciado. Los resultados indican la presencia de CTX M-2 en estas cepas de Escherichia coli.