Efectos estrogénicos del agroquímico endosulfán. Activación de un gen estrógeno-dependiente en útero de rata.

BERNHARDT T; LOWER M; SANTAMBROSIO N; MONJE L; VARAYOUD J; MUÑOZ-DE-TORO M; LUQUE EH; RAMOS JG

Santa Fe

Congreso; X Encuentro de Jóvenes Investigadores de la Universidad Nacional del Litoral, I Encuentro de Jóvenes Investigadores de Universidades de Santa Fe; 2006

Introducción Los “perturbadores endocrinos” son sustancias químicas, que se encuentran en el medio ambiente, capaces de interferir en la homeostasis de los sistemas endocrinos de un ser vivo. Son químicamente diferentes a las hormonas endógenas no obstante poseen actividad biológica hormonal o anti-hormonal, demostrada a través de algún método conocido y válido. Dentro de estas sustancias se encuentran los pesticidas organoclorados como el endosulfán, el cual es actualmente uno de los plaguicidas de elección en nuestro país para cultivos de maíz, soja, trigo, girasol, sorgo, entre otros. En el año 1994, se detectaron en nuestra provincia niveles promedio de 17 ppb de endosulfán en muestras de leche pasteurizada. En un estudio reciente realizado por toxicólogos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UBA, se observó la presencia de residuos de diferentes plaguicidas, entre ellos endosulfán, en leches maternizadas, yogures y postres que consumen bebes y niños. En el presente trabajo se determinó la actividad estrogénica del endosulfán, utilizando un modelo animal muy difundido para el estudio de perturbadores endocrinos. El mismo consiste en suministrar sustancias con actividad estrogénica a ratas hembras castradas y evaluar los efectos que se producen en un órgano blanco como el útero. Una vez finalizado el tratamiento se estudia el peso húmedo del útero y los niveles de expresión de genes estrógeno-dependientes. Si bien el aumento del peso uterino, definido como ensayo uterotrópico, es una herramienta importante para predecir actividad estrogénica de perturbadores endocrinos in vivo, se ha demostrado que este ensayo posee un bajo umbral de sensibilidad para evaluar sustancias con baja potencia. Por tal motivo, en este trabajo utilizamos una técnica ultrasensible que combina reacciones de transcripción reversa y PCR competitiva semicuantitativa para analizar la activación de factor de crecimiento endotelial (vascular endothelial growth factor, VEGF), un gen estrógeno-dependiente, involucrado en la respuesta uterina a los estrógenos. Basándose en la alta exposición a endosulfán de los animales y el hombre, el presente trabajo adquiere una importante relevancia, ya que permite determinar posibles perturbaciones de la homeostasis de un órgano fundamental para la reproducción como es el útero. Objetivos Evaluar la actividad estrogénica in vivo del plaguicida endosulfán utilizando un modelo de rata adulta ovariectomizada (OVX) y expuesta a sustancias con actividad hormonal mediante la determinación del peso húmedo del útero (definido como ensayo uterotrópico) y de la expresión del gen VEGF (estrógeno-dependiente) utilizando RT-PCR competitiva. Para esta metodología se obtuvieron en el laboratorio competidores heterólogos. Metodología Animales: Se utilizaron ratas adultas (3 meses de edad) de la cepa Wistar criadas en el bioterio del LETH, bajo condiciones controladas (22 ± 2 C, luz desde 0600 hs hasta 2000 hs), con agua y comida ad libitum. Los animales fueron ovariectomizados bilateralmente y alojados en jaulas individuales durante diez días. Posteriormente sometidos a un tratamiento que consistió en tres inyecciones subcutáneas una cada 24 horas, de acuerdo a los siguientes grupos experimentales: Control (aceite de maíz que es el vehículo utilizado), Estrógeno (17b-estradiol, 20 mg/Kg/día) y Endosulfán (6mg/Kg/día). Obtención de muestras: Cuatro horas luego de la última inyección, los animales se sacrificaron y se les extrajo porciones de cuernos uterinos: 1 cm se destinó al ensayo uterotrópico y otras porciones se colocaron en N2 líquido, para luego realizar la extracción de ARN total. Síntesis in vitro y clonado molecular de competidores heterólogos recombinantes: Utilizamos una técnica sencilla desarrollada en nuestro laboratorio para la obtención de competidores heterólogos para PCR competitiva. La misma consiste en realizar una PCR utilizando como ADN molde ADN genómico proveniente de fago lambda y como cebadores los mismos oligonucleótidos que se utilizan para amplificar el gen de rata a estudiar (ej. VEGF). Utilizando bajas temperaturas de hibridación se logra la amplificación de fragmentos del ADN de fago lambda, los cuales poseerán en los extremos terminales la secuencia de los oligonucleótidos usados como cebadores. Los fragmentos se resuelven en geles de agarosa, de los cuales se selecciona y purifica aquel cuyo peso molecular difiera en aprox. 50 pares de bases respecto del fragmento de amplificación específico del gen VEGF de rata. Dicho fragmento es clonado en un vector pBluescript con el cual se transforman bacterias E.coli DH5a. Diluciones conocidas del plásmido con el inserto competidor fueron utilizadas en las reacciones de PCR competitiva. Determinación de las variables experimentales: 1-Ensayo uterotrópico: las muestras de útero obtenidas para cada grupo experimental se pesaron en balanza analítica y se registraron los pesos/cm de útero para luego ser comparados, expresando los resultados relacionando el peso del útero con el peso del animal.. 2-Expresión de VEGF: Para semicuantificar la expresión del ARNm de VEGF se utilizó una técnica de RT-PCR competitiva. Porciones de cuernos uterinos se sometieron a extracción de ARN total, transcripción reversa y amplificación de VEGF utilizando cebadores específicos (Sense: ctgctctcttgggtgcactgg, As: ggtttgatccgcatgatctgcat, producto de 320 pb). Se utilizó la subunidad 18s del ARN ribosomal como control interno de carga de ARN total (Sense: caactttcgatggtagtcgc, As: cgctattggagctggaattac, producto de 285 pb). Para la PCR competitiva, utilizamos como competidor un plásmido pBluescript con un inserto de 290 pb, que posee en sus extremos la secuencia específica para los cebadores de VEGF. El ADN plasmídico se aisló a partir de un cultivo de E. coli usando el kit Wizard Plus SV Minipreps siguiendo las instrucciones del fabricante y se cuantificó mediante lectura en espectrofotómetro (260 nm). Sucesivas diluciones del competidor se co-amplificaron con el ADNc de las muestras de útero y los productos de las PCR se resolvieron en geles de agarosa al 2%. Para la cuantificación de la expresión de VEGF se obtuvieron fotografías utilizando una cámara digital y se analizaron mediante el software Image-Pro Plus que permite cuantificar las densidades ópticas integradas correspondientes a la señal generada por la muestra y el competidor. Cuando la relación de densidad óptica integrada de la muestra vs.el competidor es igual a 1 se calcula el número de copias del gen en estudio. Análisis estadístico: se utilizó el test de student y se aceptó un valor p<0.05 como indicador de diferencias estadísticamente significativas. Resultados: Ensayo uterotrópico: Los resultados mostraron un aumento significativo (p<0.05) en el peso húmedo del útero de los animales tratados con 17β-estradiolSIEMPRE ES CONTRA LOS CONTROLES. Para el grupo de animales tratados con endosulfán con la dosis utilizada, no se registró un aumento del peso húmedo del útero. Los resultados se muestran en la siguiente tabla:   Tratamientos Útero (mg/kg rata) Control 156.8 ± 34.4 Estradiol 700.8 ± 7.2* Endosulfán 152.2 ± 51.7 Tabla 1: Pesos húmedos de los úteros expresados en mg/kg de rata. Los resultados se muestran como media ± SEM (n=4 ratas/grupo). * indica diferencias estadísticamente significativas (p<0.05). Expresión de VEGF: Para obtener el número de copias de VEGF, se cuantificaron las intensidades de las bandas por densitometría óptica de la muestra y del competidor de acuerdo a lo descrito en metodología. Se graficó el logaritmo del cociente de intensidades de la muestra sobre el competidor vs. el número de copias del competidor. Cuando la relación de intensidades es igual a 1 el número de copias del competidor es igual al número de copias de la muestra y el logaritmo se hace igual a cero, entonces la recta obtenida corta al eje de las abscisas permitiendo conocer la expresión de VEGF para cada grupo experimental. Los resultados obtenidos muestran que tanto 17β-estradiol como endosulfán producen un aumento significativo en la expresión del ARNm de VEGF, un gen estrógeno-dependiente, con respecto al grupo control (animales OVX crónicos tratados con aceite de maíz).    Fig.2: A la izquierda se muestra la regresión lineal de graficar el logaritmo de la relación de densidades ópticas de la muestra y el competidor vs. el número de copias del competidor. A la derecha se grafica la diferencia entre el número de copias del ARNm del gen VEGF para los diferentes grupos experimentales. Conclusiones: En base a los resultados obtenidos concluimos que el endosulfán presenta actividad estrogénica in vivo al estimular la expresión de un gen estrógeno dependiente como VEGF, en el modelo animal utilizado y con la dosis empleada. Debido a que el ensayo uterotrópico es un test menos sensible, con este procedimiento no se detectó actividad estrogénica del endosulfán. Es importante destacar que, al ser una experiencia realizada in vivo, los efectos de perturbación endocrina encontrados en animales deberían ser estudiados más profundamente para poder inferir sobre los daños que podría provocar en humanos la exposición a este plaguicida de uso tan difundido.