Efectos del xenoestrógeno bisfenol a sobre eventos moleculares uterinos hormonodependientes.

LOWER M; BERNHARDT T; SANTAMBROSIO N; MONJE L; MUÑOZ-DE-TORO M; LUQUE EH; RAMOS JG; VARAYOUD J

Santa Fe

Congreso; X Encuentro de Jóvenes Investigadores de la Universidad Nacional del Litoral, I Encuentro de Jóvenes Investigadores de Universidades de Santa Fe.; 2006

Introducción: Desde finales de los años sesenta se sabe que algunas sustancias químicas presentes en el medio ambiente y producidas por el hombre, poseen actividad hormonal. Dentro de estas sustancias definidas como perturbadores endocrinos se encuentran los xenoestrógenos (o estrógenos sintéticos) los cuales tienen la capacidad de actuar como agentes hormonalmente activos, imitando o antagonizando la acción de los estrógenos endógenos. Un xenoestrógeno muy estudiado es el bisfenol A (BPA), ampliamente empleado en la fabricación de plásticos, policarbonatos con los que se fabrican envases para alimentos y mamaderas, en resinas epoxi que recubren el interior de latas de conserva, en sellantes odontológicos, etc. Resultados obtenidos en nuestro laboratorio demuestran que el BPA altera el eje hipotalámico-hipofisario-gonadal tanto en machos como en hembras de diferentes especies. Recientemente hemos demostrado en ratas que este xenoestrógeno administrado en etapas críticas del desarrollo de tejidos hormonodependientes, disminuye la fertilidad femenina y aumenta la susceptibilidad al desarrollo de tumores de mama en respuesta a carcinógenos químicos. Cuando el útero es expuesto a un estrógeno se inducen cambios en la expresión de genes, hipertrofia celular, síntesis de ADN y cambios vasculares, los cuales han sido ampliamente utilizados para evaluar la actividad de compuestos estrogénicos in vivo. Un gen inducido por estrógenos y de vital importancia en la regulación de la permeabilidad vascular y el crecimiento de los vasos sanguíneos en el útero es el factor de crecimiento endotelial (vascular endothelial growth factor, VEGF). En el presente trabajo estudiamos si el BPA es capaz de inducir cambios histológicos y moleculares similares a los observados con el estrógeno natural 17-b estradiol, utilizando como modelo in vivo el útero de la rata castrada. Objetivo: Estudiar los efectos del BPA en el útero de la rata adulta castrada determinando cambios en el peso húmedo del útero (definido como ensayo uterotrópico) y en la expresión del gen VEGF (estrógeno-dependiente) utilizando RT-PCR competitiva. Para esta última metodología se obtendrán en el laboratorio competidores heterólogos. Metodología Animales: Se utilizaron ratas adultas (3 meses de edad) de la cepa Wistar criadas en el bioterio del LETH, bajo condiciones controladas (22 ± 2 C, luz desde 0600 hs hasta 2000 hs), con agua y comida ad libitum. Los animales fueron ovariectomizados bilateralmente y alojados en jaulas individuales durante diez días. Posteriormente se sometieron a un tratamiento que consistió en tres inyecciones subcutáneas diarias, de acuerdo a los siguientes grupos experimentales: Control (aceite de maíz que fue el vehículo utilizado), Estrógeno (17b-estradiol, 20 mg/Kg/día) y BPA (Bisfenol A, 50 mg/Kg/día). Obtención de muestras: Cuatro horas luego de la última inyección, los animales se sacrificaron y se les extrajo diferentes porciones de los cuernos uterinos: 1 cm se destinó al ensayo uterotrópico y otras porciones se colocaron en N2 líquido y se guardaron en freezer a –80°C, para luego realizar la extracción de ARN total. Síntesis in vitro y clonado molecular de competidores heterólogos recombinantes: Utilizamos una técnica sencilla desarrollada en nuestro laboratorio para la obtención de competidores heterólogos para PCR competitiva. La misma consiste en realizar una PCR utilizando como ADN molde ADN genómico proveniente de fago lambda y como cebadores los mismos oligonucleótidos que se utilizan para amplificar el gen de rata a estudiar (ej. VEGF). Utilizando bajas temperaturas de hibridación se logra la amplificación de fragmentos del ADN de fago lambda, los cuales poseen en sus extremos terminales la secuencia de los oligonucleótidos usados como cebadores. Los fragmentos se resuelven en geles de agarosa, de los cuales se selecciona y purifica aquel cuyo peso molecular difiera en aprox. 50 pares de bases respecto del fragmento de amplificación específico del gen VEGF de rata. Dicho fragmento es clonado en un vector pBluescript con el cual se transforman bacterias E.coli DH5a. Diluciones conocidas del plásmido con el inserto competidor fueron utilizadas en las reacciones de PCR competitiva. Determinación de las variables experimentales: 1-Ensayo uterotrópico: Muestras de útero de la misma longitud se obtuvieron en los distintos grupos experimentales, se pesaron en balanza analítica y se registraron los pesos para luego ser comparados, los resultados se expresaron como peso del útero/cm.. 2-Expresión de VEGF: Para semicuantificar la expresión del ARNm de VEGF se utilizó una técnica de RT-PCR competitiva. Porciones de cuernos uterinos se sometieron a extracción de ARN total, transcripción reversa y amplificación de VEGF utilizando cebadores específicos (Sense: ctgctctcttgggtgcactgg, As: ggtttgatccgcatgatctgcat, producto de 320 pb). Se utilizó la subunidad 18s del ARN ribosomal como control interno de carga de ARN total (Sense: caactttcgatggtagtcgc, As: cgctattggagctggaattac, producto de 285 pb). Para la PCR competitiva, utilizamos como competidor un plásmido pBluescript con un inserto de 290 pb, que posee en sus extremos la secuencia específica para los cebadores de VEGF. El ADN plasmídico se aisló a partir de un cultivo de E. coli usando el kit Wizard Plus SV Minipreps siguiendo las instrucciones del fabricante y se cuantificó mediante lectura en espectrofotómetro (260 nm). Sucesivas diluciones del competidor se co-amplificaron con el ADNc de las muestras de útero y los productos de las PCR se resolvieron en geles de agarosa al 2%. Para la cuantificación de la expresión de VEGF se obtuvieron fotografías utilizando una cámara digital y se analizaron mediante el software Image-Pro Plus que permite cuantificar las densidades ópticas integradas correspondientes a la señal generada por la muestra y el competidor. Cuando la relación de densidad óptica integrada de la muestra vs. el competidor es igual a 1 se calcula el número de copias del gen en estudio. Análisis estadístico: Se utilizó el test de student y se aceptó un valor p<0.05 como indicador de diferencias estadísticamente significativas. Resultados Ensayo uterotrópico: Los resultados mostraron un aumento significativo (p<0.05) en el peso húmedo del útero de los animales tratados tanto con 17 β-estradiol como con BPA (Fig. 1) con respecto a los controles tratados con vehículo.  Fig. 1: Resultados del ensayo uterotrópico (determinación del peso húmedo del útero/cm). Los resultados se expresan como la media ± SEM (n=4 ratas/grupo).   Expresión de VEGF: Para obtener el número de copias de VEGF, se cuantificaron las densidades ópticas integradas de las bandas de la muestras y del competidor de acuerdo a lo descrito en metodología. Cuando la relación de intensidades es igual a 1 el número de copias del competidor es igual al número de copias del gen en estudio en la muestra, lo que permite conocer la cantidad de VEGF en cada grupo experimental. Los resultados obtenidos muestran que los animales tratados con 17β-estradiol y con BPA (Fig. 2) presentan un aumento significativo en la expresión del ARNm de VEGF respecto de los controles tratados con vehículo (aceite de maíz). Fig.2: Cuantificación del número de copias del ARNm del gen VEGF en los distintos grupos experimentales determinado por densitometría óptica. Los resultados se muestran como la media ± SEM (n=4 ratas/grupo).   Conclusiones: En el presente trabajo demostramos que la administración de BPA provoca aumento del peso húmedo del útero e induce la expresión del gen VEGF (estrógeno-dependiente) en niveles semejantes al grupo control positivo (inyectado con 17β-estradiol). El gen del VEGF es el mediador de procesos de angiogénesis en diferentes órganos, entre ellos el útero, un evento clave en procesos fisiológicos (ie: implantación) como patológicos (ie: crecimiento y progresión de procesos tumorales). Debido a la alta abundancia de BPA en el medio ambiente es imprescindible determinar los efectos de este xenoestrógeno sobre órganos blanco para conocer las posibles consecuencias en la salud humana y de los animales a la exposición con este contaminante.