INVESTIGADORES
URTREGER Alejandro Jorge
informe técnico
Título:
Informe Científico Final, PICT-2010-00487
Autor/es:
ALEJANDRO J. URTREGER; LAURA B. TODARO
Fecha inicio/fin:
2011-08-26/2014-02-26
Naturaleza de la

Producción Tecnológica:
Biológica
Campo de Aplicación:
Salud humana
Descripción:
El péptido P15-Tat (también llamado CIGB-300) es un inhibidor competitivo de la proteína quinasa CK2, enzima que fosforila numerosas proteínas involucradas en crecimiento y supervivencia celular. Estudiamos el efecto del P15-Tat sobre vías de señalización implicadas en la progresión tumoral empleando como tres líneas celulares de cáncer de pulmón (NCI-H125, 3LL y LP07). En primera instancia pudimos determinar que el P15-Tat presenta una importante actividad antiproliferativa in vitro. Mientras que la concentración inhibitoria 50 (IC50) fue de 119±2,4 uM para las células pulmonares humanas NCI-H125 y de 138,3±9,9 uM para las células murinas 3LL, las células murinas LP07 resultaron altamente resistentes con una IC50 de 278±11,8 uM. Por inmunofluorescencia con Anexina V-FITC observamos que luego de 1 h de tratamiento el P15-Tat induce apoptosis, en niveles comparables a otros inductores conocidos como el Etopósido (10 uM). Además, en forma concomitante con la inducción de muerte celular, se observó por WB la activación de la caspasa-3 y la disminución en la expresión de c-myc y las ciclinas D1 y D2. También mediante WB, pudimos determinar que tratamiento con P15-Tat no modula la vía PI3K/Akt, altamente implicada en procesos de sobrevida celular en ninguna de las líneas celulares analizadas. Por otro lado, la vía ERK/MAPK, implicada en proliferación celular, mostró una importante reducción en los niveles de ERK1/2 fosforilado (activo) en las líneas NCI-H125 y LP07. Los componentes de las vías de Wnt y NFkB se estudiaron exahustivamente por WB luego del tratamiento con P15-Tat. Un punto clave en la vía de señalización de Wnt es la regulación de la estabilidad de la proteína citoplasmática b-catenina, que actúa como activador transcripcional favoreciendo la expresión de genes involucrados en proliferación celular. A fin de analizar el efecto del P15-Tat sobre la vía Wnt, la misma se activó por incubación con medio condicionado conteniendo Wnt3a lo que indujo un importante incremento en los niveles citoplasmáticos de b-catenina. El P15-Tat fue capaz de bloquear dicho aumento en forma dependiente de la dosis en las tres líneas celulares, confirmando su rol en la modulación de la vía de Wnt. Similares resultados se obtuvieron por tratamiento con TBB, inhibidor competitivo de CK2. En condiciones constitutivas ni el con P15-Tat ni el TBB fueron capaces de alterar los niveles citoplasmáticos de b-catenina. El factor de transcripción kB (NFkB), es un dímero proteico que requiere de la separación de su inhibidor (IkB) para traslocarse al núcleo y activar la transcripción de genes involucrados en sobrevida celular. La vía dependiente de NFkB, se activo por tratamiento con el éster de forbol PMA (24 hs, 15 nM). Un tratamiento corto (15 min) con P15-Tat fue capaz de bloquear el incremento en los niveles de NFkB (subunidad p65) en el núcleo celular, inducidos por PMA, sin alterar los niveles citoplasmáticos de IkB. Cuando se analizó el efecto del P15-Tat a tiempos más largos (60 min), ni P15-Tat ni el TBB fueron capaces de inducir alteraciones en esta vía de señalización intracelular ya sea en condiciones constitutivas o luego de activación con PMA, según se determinó mediante ensayos de WB y expresión de genes reporteros. La capacidad invasiva es un efecto biológico ampliamente asociado al proceso de diseminación metastásica. Pudimos determinar que el tratamiento con P15-Tat indujo una reducción dependiente de la dosis en la capacidad migratoria de las líneas celulares pulmonarias 3LL y LP07. La línea celular NCI-H125 mostró el mismo comportamiento aunque estas diferencias no alcanzaron significación estadística. En relación a la modulación del crecimiento 3D, logramos desarrollar esferoides de NCI-H125 que se mantuvieron en cultivo durante al menos 15 días. El tratamiento de estos cultivos con P15-Tat indujo una significativa inhibición en su crecimiento luego de 5 días. Es importante destacar que se observó además una drástica reducción en el volumen de los esferoides luego de 7 días de tratamiento. En líneas generales podemos concluir que el P15-Tat induce una importante respuesta anti-proliferativa en dos y tres dimensiones afectando vías de señalización clave en la progresión tumoral en las cuales interviene la CK2. La importante respuesta al tratamiento observada en el modelo tridimensional, que se asemeja a las condiciones de un tumor in vivo, sugiere la utilidad de esta droga para un posible abordaje terapéutico para el cáncer de pulmón. También hemos realizamos numerosos avances en lo que respecta a otras proteínas quinasas de función similar a la CK2 como lo es la proteína quinasa C (PKC). Por un lado analizamos la interacción entre las PKC con el sistema retinoideo ya que los retinoides ejercen algunos de sus efectos sobre la diferenciación celular y la reversión del fenotipo maligno a través de interacciones con distintas isoformas de PKC. Nuestros estudios revelaron que PKCa y PKCd son fundamentales para la activación de receptores retinoideos. Además, PKCd viajaría al núcleo junto con el receptor retinoido RARa y formaría parte de la maquinaría transcripcional mientras que PKCa tendría un efecto directo sobre la progresión maligna a la vez que sensibiliza, al efecto diferenciador y/o inhibitorio del crecimiento de los retinoides. Por otro lado, como miembros de la familia de PKC podrían modular la progresión del cáncer de páncreas estudiamos el efecto de PKCb1 sobre diferentes determinantes críticos de la progresión tumoral empleando células pancreáticas humanas PANC1. Pudimos determinar que PKCb1 induce una importante reducción en la capacidad proliferativa que se pudo asociar con una disminución en los niveles de ciclina D1, ciclina D2 y pERK 1/2, como así también al aumento en los niveles de p21. Además, PKCb1 incrementó el potencial adhesivo y redujo la capacidad invasiva de las células pancreáticas. Este comportamiento se asoció con la inhibición de la secreción de proteasas. Finalmente, las células Panc1-PKCb1 fueron incapaces de generar tumores en ratones nude. Así, la expresión de PKCb en células pancreáticas conferiría un fenotipo menos agresivo ya que modularía eventos que limitan el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica.