Informe Científico Técnico Final PICT-2008-01377

LAURA B. TODARO; ALEJANDRO J. URTREGER

2008-03-26/2010-04-23

Biológica

Salud humana

Objetivo general: definir cuál es la interacción existente entre la vía de señalización de los retinoides y de PKC en la regulación de la progresión maligna de líneas celulares derivadas de tumores mamarios, empleando estudios in vivo e in vitro y estrategias farmacológicas y genéticas, en vistas de poder abordar en futuros y mejores tratamientos para este tipo de patologías. Con respecto a esta línea de trabajo, hemos repetido experimentos para confirmar resultados obtenidos en el período anterior. Además se ha avanzado en el estudio del crosstalk entre el sistema retionideo y la vía de señalización de las PKC. Particularmente nos habíamos propuesto discriminar la participación específica de las diferentes isoformas de PKC en los efectos modulados por ATRA, empleando el silenciamiento farmacológico o genético de distintas isoformas de PKC. También evaluar si el efecto del ATRA se debe a la interacción nuclear de la PKC con los receptores retinoideos y si el efecto del ATRA se produce por la unión directa de este metabolito con alguna isoforma PKC en el citoplasma celular. Análisis de la expresión de los receptores retinoides (RARs), en células tratadas con PMA: En las células murinas, el tratamiento con PMA (activador de PKC) inhibió la expresión de todos los receptores retinoideos. El tratamiento con PMA indujo aumento en los niveles de expresión de RARa1, RARa2 y RARg2 en las células tumorales mamarias humanas MDA-MB231. Modulación de la expresión de PKCs por tratamiento con retinoides: Mediante Western blot hemos analizado la expresión de las isoformas a y d de PKC, cuando las células fueron tratadas con ATRA (1 uM, 6 - 24 hs). Este tratamiento indujo un incremento en los niveles de expresión de las isoformas a y d de PKC en la línea murina NMuMG (normal) y una reducción de PKCa y aumento de PKCd en la línea LM3 (tumoral). En las células tumorales mamarias humanas MDA-MB231, el mismo tratamiento indujo una importante reducción en los niveles expresión de ambas isoformas de PKC. Efecto del ATRA sobre el crecimiento: Dado que el ATRA es capaz de inducir diferenciación y/o muerte celular en distintos modelos tanto in vivo como in vitro, analizamos la capacidad proliferativa de las células LM3, NMuMG y MDA-MB231 en respuesta al tratamiento con ATRA. Se realizaron varios ensayos de crecimiento por recuento. Confirmando que las líneas celulares murinas mostraron una reducción significativa en la capacidad proliferativa a partir de las 48 hs de tratamiento, mientras que la línea humana MDA-MB231 no fue sensible ante el mismo tratamiento retinoide. Modulación de la expresión de moléculas relacionadas a sobrevida, proliferación y ciclo celular El tratamiento con ATRA indujo una reducción de los niveles de pERK1 en LM3 y NMuNG. Ambas líneas mostraron activación de la vía PI3K/Akt e incremento de los niveles de p27. En contraste, la expresión de la Ciclina D1 fue diferente dependiendo de la línea celular. En LM3 luego de 72 hs de tratamiento retinoideo pudimos ver además del aumento en la expresión del inhibidor del ciclo celular p27, su translocación al núcleo de las células , aunque no hubo diferencias en Ciclina D1 en este compartimento subcelular. En MDA-MB231, el tratamiento retinoideo, no modifico la vía ERK/MAPK ni PI3K/Akt. Tampoco se detecto expresión de p27 ni alteración en los niveles de Ciclina D1. Modulación en la actividad de los receptores retinoideos por la activación/silenciamiento farmacológico de diferentes isoformas de PKC: El silenciamiento farmacológico de PKCa (Gö6976) o PKCd  (Rottlerin) en LM3, no permitió la activación de los receptores retinoides. Este efecto fue evaluado a través de un ensayo con un gen reportero Luciferasa, bajo un promotor conteniendo el elemento de respuesta al acido retinoico (RARE-Luc). La activación de todas las isoformas de PKC, a través del tratamiento con PMA, no alteró el efecto genómico mediado por ATRA. Efecto del tratamiento combinado de ATRA con inhibidores farmacológicos de PKCa y PKCd, sobre la expresión y localización subcelular de receptores retinoideos y PKCs. La inhibición farmacológica de PKCd  combinado con el tratamiento con ATRA, causa tanto una disminución en los niveles de PKCd como del receptor RARa, conjuntamente con la inhibición de la translocación de ambos al núcleo celular. Por otro lado la combinación de ATRA con el inhibidor farmacológico de PKCa no altera ni la expresión ni la localización subcelular de RARa y PKCd. En la línea LM3, el efecto genómico mediado por ATRA a través de la activación de los receptores retinoideos nucleares, depende en parte de la translocación de PKCd al núcleo. Existe una relación entre el incremento de PKCd y la inhibición del crecimiento mediada por ATRA. Además la activación de PKCd es necesaria para que RARa se transloque al núcleo. Es posible que ambas moléculas viajen juntas al núcleo celular. ya que inmunopresipitan juntas. Por otro lado se ha logrado transfectar en forma estable ambas líneas murinas (NMuMG y LM3) para que sobreexpresen PKCa y PKCd. Por lo tanto contamos con tres sulineas: LM3-PKCa, LM3-PKCd y LM3-PMTH (vector solo), ademas de las tres correspondientes a NMuMG. A pesar de haber costado mucho la obtencion de estas sublíneas están en marcha los protocolos in vivo. Donde los ratones BALB/c recibieron la inoculación ortotópica de las sublíneas LM3 y al momento en que estos tumores sean palpables recibirán un pellet conteniendo o no tratamiento con ATRA. También se fraccionó lisado y medio condicionado proveniente de estas sublíneas modificadas creciendo en presencia o ausencia de ATRA para evaluar actividad de metaloproteasas (MMP) y activador de plasminógeno tipo uroquinasa (uPA), relacionado a la diseminación metastásica. Objetivos que se habían planteado: 1) Analizar si el tratamiento con la forma trans del Ácido Retinoico (ATRA, 1uM) modula la expresión y/o actividad de alguna de las isoformas de PKC. Este objetivo fue cumplido en su totalidad. 2) Analizar si existe alteración en la expresión o activación de moléculas río abajo de las PKC, cuando las células se tratan con ATRA. Este objetivo fue cumplido en su totalidad. 3) Evaluar si la activación de las PKC utilizando ésteres de forbol (como el PMA), sensibilizan a las células al tratamiento con ATRA. También podrá analizarse la respuesta al mismo tratamiento cuando las células son modificadas genéticamente para sobreexpresar alguna de las isoformas de la familia PKC. En relación a este objetivo pudo cumplirese en parte debido a que necesitamos conseguir las sublíneas modificadas genéticamente, aquí se realizaron múltiples transfecciones y selecciones para lograrlo. 4) Para discriminar la participación específica de las diferentes isoformas en los efectos modulados por ATRA, se empleará el silenciamiento farmacológico o genético de distintas isoformas de PKC. Se analizarán algunos efectos biológicos relacionados a crecimiento y diseminación metastásica. Este objetivo fue cumplido casi en su totalidad utilizando la estrategia farmacológica. Continúa en marcha los ensayos de actividad biológica utilizando las líneas transfectadas. 5) Evaluar si el efecto del ATRA se debe a la interacción nuclear de la PKC con los receptores retinoideos (RAR/RXR). Se ha cumplido en su totalidad. 6) Evaluar si el efecto del ATRA se produce por la unión directa del ATRA con alguna isoforma PKC en el citoplasma celular. Si bien tenemos evidencia sobre que la unión del ATRA a PKC sería en forma indirecta, no hemos podido realizar experimentos bioquímicos que lo confirmen, aún. Aunque tenemos arreglado realizarlo en uno de los laboratorios que forman parte de nuestra nueva red y que tienen experiencia en detecciones de actividad enzimática in vitro. 7) En una siguiente etapa se evaluará la eficiencia del tratamiento oral con ATRA de ratones BALB/c portadores de la línea LM3 o F3II modificadas genéticamente para sobreexpresar o no, la isoforma PKC involucrada. Este objetivo se encuentra en desarrollo. Los ratones ya han sido inoculados ortotópicamente con las sublíneas logradas para la sobreexpresión de PKCa y PKCd con sus respectivos controles. Estamos próximos al comienzo del tratamiento retinoide. Se han podido cumplir con más del 85% de los objetivos planteados. Incluso está en marcha el objetivo 7 de experimentación.