Desarrollo de una mutante atenuada de Staphylococcus aureus por intercambio alélico para estudios de interferencia bacteriana.

BARBAGELATA, MARIA SOL; ALVAREZ LUCIA P.; BUZZOLA, FERNANDA R.; SORDELLI, DANIEL O.

Cordoba, Argentina

Congreso; XI Congreso Argentino de Microbiología; 2007

Asociación Argentina Microbiología (AAM)

Numerosas estrategias han sido desarrolladas para la generación de reemplazos génicos en cromosomas bacterianos. La recombinación homóloga de un gen cromosomal por un alelo mutado es una atractiva herramienta para generar mutantes bacterianas. La inactivación génica en Staphylococcus aureus es dificultosa. Recientemente se describió un nuevo plásmido shuttle (pMAD) que contiene un origen de replicación sensible a la temperatura, un gen de resistencia a la eritromicina (Em) y constitutivamente expresa el gen de la β-galactosidasa permitiendo una identificación rápida y simple del evento de doble recombinación en ensayos en placa. En este trabajo se construyó y caracterizó una mutante de S. aureus aroA obtenida por intercambio alélico para ser utilizada en estudios de interferencia bacteriana en cultivos de epitelio nasal humano. El gen aroA de la cepa salvaje RN6390 se clonó en el vector pGEM. El gen salvaje aroA se interrumpió con la inserción de un cassette de Kanamicina (Ka) en el sitio 1334. Esta construcción se clonó en pMAD y el plásmido resultante pMAD-1 se transformó en RN6390 por electroporación. Mediante incubación a la temperatura no permisiva (44ºC) se indujo el evento de recombinación homóloga entre el plásmido y el cromosoma. La escisión del plásmido del cromosoma, que conduce al intercambio alélico con el pMAD-1, se alcanzó por incubación a la temperatura permisiva (30ºC). Las colonias blancas sensibles a Em y resistentes a Ka, que ya no contienen pMAD-1, se caracterizaron molecularmente por PCR y posterior secuenciación para confirmar el reemplazo alélico. La caracterización fenotípica se evidenció a través de la deficiencia para crecer en ausencia de los aminoácidos aromáticos y sus precursores. La frecuencia de reversión al fenotipo salvaje se determinó por crecimiento en placas de medio mínimo. Con el propósito de establecer la atenuación de la mutante aroA de reemplazo alélico con respecto a la cepa parental se analizó la supervivencia de los animales inoculados con ambas cepas por vía intraperitoneal.   La nueva estrategia descripta posibilitó obtener una mutante auxótrofa aroA de S. aureus estable y atenuada que permite ser utilizada en estudios de interferencia bacteriana.