INVESTIGADORES
SEIJO Jose Guillermo
congresos y reuniones científicas
Título:
Caracterización genómica de las especies tetraploides y diploides afines de la sección Arachis por FISH y GISH
Autor/es:
SEIJO, J.G.; BERTIOLI, D.J; LAVIA, G.I; S. LEAL-BERTIOLI; GHILMARHAES, P.
Lugar:
Río Cuarto, Córdoba
Reunión:
Congreso; V Reunión iternacional de Especialistas en Arachis.; 2006
Institución organizadora:
´Fundación Maní Argentino
Resumen:
CARACTERIZACIÓN GENÓMICA POR FISH Y GISH DE LAS ESPECIES TETRAPLOIDES DE LA SECCIÓN ARACHIS Y DE SUS DIPLOIDES AFINES       Seijo JG1 *, DJ Bertioli2, PM Guimarães3,  GI Lavia1 , S Leal-Bertioli3, EA Moscone4. 1Instituto de Botánica del Nordeste (IBONE)-CONICET, C.C. 209, 3400 Corrientes, Argentina. 2Universidad Católica de Brasilia, campus II, SGAN 916, Brasilia DF CEP 70.790-160. Brasil.  . 3EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia. Parque Estación Biológica, CP 02372. Final W5 Norte, Brasilia, DF CEP 70.770-900. Brasil.  4Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal, Casilla de Correo 495, 5000 Córdoba, Argentina. seijo@agr.unne.edu.ar.     La sección Arachis posee dos especies tetraploides, el cultígeno Arachis hypogaea L. (2n= 4x= 40) y la silvestre A. monticola Krapov. & Rigoni. Asimismo, se reconocen 30 especies diploides (2n= 2x= 20, 2n= 2x=18) (Krapovickas & Gregory, 1994; Valls & Simpson, 2005). Hasta el momento se han descripto tres genomas dentro de la sección,  “A” y  “B” cada uno representado aproximadamente en la mitad de las especies, y “D” únicamente presente en A. glandulifera Stalker (Smartt & al., 1978; Singh & Moss, 1984; Stalker, 1991; Fernández & Krapovickas, 1994).  Los tetraploides fueron descriptos como aloploides con una composición genómica 2n= 4x (2A+2B)= 40. Mediante la utilización de genes de rRNA 5S y 45S se ha demostrado gran afinidad genética entre el cultígeno y A. monticola, sustentándose la aparición del primero por domesticación del segundo. También se ha propuesto a A. ipaensis Krapov. & W.C. Gregory y A. duranensis Krapov. & W.C. Gregory como los progenitores diploides (2n= 2x= 20) que donaron los genomas A y B respectivamente a los tetraploides (Seijo & al. 2004). Sin embargo, A. duranensis, con una distribución geográfica similar a los tetraploides (NO Argentina), comparte con A. correntina (Burkart) Krapov. & W.C. Gregory y A. villosa Benth (NE Argentina) un mismo patrón de distribución de los genes ribosómicos; así, estas últimas entidades no pueden descartarse como posibles parentales. Para probar la hipótesis de que A. ipaensis y A. duranensis han intervenido en el origen de A. monticola/A. hypogaea, en este trabajo se utilizó DNA genómico para investigar por hibridación in situ fluorescente la constitución genómica de los tetraploides y las relaciones genómicas con las especies diploides. Por otra parte, se han analizado los patrones de hibridación de diversas secuencias repetidas a fin de realizar inferencias sobre los mecanismos de diferenciación que han ocurrido entre los genoma “A” y “B” de Arachis.   MATERIAL Y MÉTODOS      El material examinado fue obtenido del banco de germoplasma del INTA Manfredi (Córdoba) y del Instituto de Botánica del Nordeste (Corrientes). Para realizar las preparaciones cromosómicas se emplearon raíces secundarias pretratadas con 8-hidroxiquinoleína según Fernández & Krapovickas (2004) y fijadas en 3:1 (etanol/ácido acético) a 4º C. El aplastamiento de los ápices radicales se efectuó en ácido acético 45% luego de digerirlos con solución enzimática. El marcado de las sondas (ADN genómico y secuencias repetidas) con biotina o digoxigenina por "nick translation", el pretratamiento de los preparados, las condiciones de hibridación, el bloqueo, los lavados y la detección de las sondas por inmunofluorescencia se realizaron de acuerdo al protocolo utilizado en Seijo & al. (2004). Los preparados fueron teñidos y montados con "Vectashield" conteniendo DAPI. Los cromosomas fueron observados con un microscopio de epifluorescencia equipado con cámara digital. Se han ensayado todas las combinaciones posibles entre los siete parentales putativos de A. monticola y A. hypogaea, incluyendo en cada combinación de sondas una especie con genoma “A” y una con genoma “B”, las cuales fueron hibridadas sobre los cromosomas de los tetraploides. Para tratar de evitar errores de interpretación por diferencia en la calidad de las sondas marcadas cada una de las mismas fue hibridada sobre los cromosomas de la propia especie y población de la que se extrajo el DNA. Sólo las sondas que presentaron patrones de hibridación uniformes y con alta intensidad sobre los propios cromosomas fueron utilizadas para analizar los tetraploides.   RESULTADOS  Y DISCUSIÓN De las doce combinaciones ensayadas sobre las dos subespecies y seis variedades de A. hypogaea y A. monticola, aquella con las sondas de A. duranensis y A. ipaensis presentó el mejor patrón de hibridación, tanto en intensidad de fluorescencia como en uniformidad de cobertura. Utilizando esta combinación, el DNA genómico de A. duranensis hibridó preferentemente con 20 cromosomas, todos ellos con bandas heterocromáticas, y el DNA de A. ipaensis lo hizo con los 20 cromosomas restantes, todos sin bandas heterocromáticas. Notablemente, los cromosomas pequeños A9 así como el brazo corto y segmento proximal del brazo largo de los cromosomas A10-SAT, presentaron baja intensidad de hibridación. Sin embargo, el satélite de este último par presentó una fluorescencia semejante a la presentada por el resto del complemento “A” de los tetraploides. Por otra parte, al analizar el patrón de hibridación a lo largo de los cromosomas del complemento “A”, se observaron dos regularidades: 1) las regiones centroméricas heterocromáticas presentaron poco o nada de hibridación, y 2) las regiones pericentroméricas adyacentes a la zona antes citada son las que mostraron mayor intensidad de fluorescencia.  La primer regularidad puede reflejar una menor accesibilidad de las sondas a las regiones con bandas heterocromáticas, y la segunda a una mayor frecuencia de secuencias repetidas. En cuanto a las demás especies consideradas como pertenecientes al genoma “A”, las combinaciones de sondas que incluyeron DNA genómico de A. villosa, A. correntina y A. cardenasii Krapov. & W.C. Gregory presentaron un patrón de hibridación semejante al observado cuando las combinaciones incluyeron DNA de A. duranensis. Sin embargo, las intensidades y uniformidad de hibridación decrecieron de acuerdo al orden citado. Arachis villosa presentó el patrón más parecido a A. duranensis, y la intensidad de hibridación de A. correntina y A. cardenasii fue parecida entre sí pero menor que A. villosa. Por otra parte, las otras especies con genoma “B” aquí incluidas, A. batizocoi Krapov. & W.C. Gregory y A. williamsii Krapov. & W.C. Gregory, hibridaron menos eficientemente los cromosomas de A. hypogaea que A. ipaensis. Arachis batizocoi fue el que presentó un patrón de hibridación más cercano a A. ipaensis, mientras que A. williamsii solamente hibridó con buena intensidad en algunos sectores (pequeñas marcas por cromosoma) del genomio “B” de los tetraploides. Estos resultados confirman que A. hypogaea es un alotetraploide con la mitad de sus cromosomas con bandas heterocromáticas. El hecho de que todas las variedades tengan el mismo patrón de hibridación genómica,  así como de loci de rDNA, sugiere que el maní cultivado se ha originado en un sólo evento de alopoliploidización, o si en múltiples, siempre involucrando a las mismas especies diploides. La gran homología encontrada entre A. hypogaea y A. monticola sustenta la hipótesis de que el cultígeno habría surgido por domesticación del alotetraploide silvestre. Además, los patrones hibridaciones genómicas con DNA de los diploides nos permiten inferir que A. duranensis y A. ipaensis son los progenitores más probables de A. hypogaea/A. monticola, ya que presentan las hibridaciones  más fuertes y  uniformes que cualquiera de las otras especies analizadas. Con respecto a las investigaciones llevadas a cabo para inferir los mecanismos de diferenciación genómica en la sección Arachis, de las cinco secuencias repetidas ensayadas cuatro hibridaron preferentemente con los cromosomas del genoma “A”  y una con el genoma “B” de A. hypogaea. Los patrones de hibridación observados muestran que todas las secuencias son dispersas. Sin embargo, ninguna de las secuencias hibridó con las bandas heterocromáticas del genoma “A” por lo que corresponden a secuencias propias de la eucromatina de cada genoma. Asimismo, presentaron una mayor intensidad de fluorescencia en las regiones  adyacentes a las bandas pericentroméricas, coincidiendo con los patrones de hibridación observados en los GISH. Las secuencias que han hibridado con el genoma “A” presentan homología con distintas regiones de retroelementos, entre ellos una transcriptasa reversa. Por otra parte, la secuencia que hibridó específicamente con el genoma “B” se solapa con alguno de los elementos específicos para el genoma “A”, por lo que se podría tratar de una secuencia quimera. El análisis de esta secuencia y su importancia en la constitución genómica de las especies de la sección Arachis constituye uno de los objetivos de futuras investigaciones. Los resultados hasta ahora alcanzados sugieren  que gran parte de la diferenciación genómica dentro de la sección Arachis ha ocurrido como consecuencia de diversificación de secuencias repetidas dispersas y que estas secuencias guardarían homología con retroelementos.       REFERENCIAS Fernández, A & A Krapovickas. 1994. Cromosomas y evolución en Arachis (Leguminosae). Bonplandia 8: 187-220. Krapovickas, A & WC Gregory. 1994. Taxonomía del género Arachis (Leguminosae). Bonplandia 8: 1-186. Seijo, JG, GI Lavia, A Fernández, A Krapovickas, D Ducasse & EA Moscone. 2004. Physical mapping of 5S and 18S-25S rRNA genes evidences that Arachis duranensis and A. ipaensis are the wild diploid species involved in the origin of A. hypogaea (Leguminosae). Amer. J. Bot. 91:2093-2303. Singh, AK & JP Moss. 1984. Utilization of wild relatives in genetic Improvement of Arachis hypogaea L. 5. Genome analysis in Section Arachis and its implications in gene transfer. Theoretical and Applied Genetics 68: 355-364. Smartt, J, WC Gregory & MP Gregory. 1978. The genomes of Arachis hypogaea. 1. Cytogenetic studies of putative genome donors. Euphytica 27: 665-675. Stalker, HT. 1991. A new species in section Arachis of peanuts with a D genome. American Journal of Botany 78: 630-637. Valls, JFM & CE Simpson. 2005. New species of Arachis (Leguminosae) from Brazil, Paraguay and Bolivia. Bomplandia 14: 35-63.   AGRADECIMIENTOS A la Comunidad Europea (INCO-DEV contract no. ICA4-CT - 2001-10072)  y al CGIAR, CP, subprogram: Trait capture for crop improvement. 2005-2008 por el apoyo financiero brindado.
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