Efecto del extracto de Larrea divaricata sobre la ultraestructura de Botrytis cinerea.

HAPON M.V.; BOITEUX J.J; LUCERO G.S; MONARDEZ C.S; PIZZUOLO P.H

San Miguel de Tucumán

Congreso; III Congreso Argentino de Fitopatología; 2014

Asociación Argetina de Fitopatólogos

Efecto del extracto de Larrea divaricata sobre la ultraestructura de Botrytis cinerea   Introducción Botrytis cinerea Pers. es considerado un hongo sumamente polífago que afecta innumerables cultivos de importancia agrícola. Entre las estructuras más importantes que participan en su propagación, en nuestro medio, se encuentran conidios, micelio vegetativo y esclerocios. Por esto para poder controlar las enfermedades ocasionadas por este patógeno los mayores esfuerzos se centran en la inhibición de la germinación de las esporas y de la proliferación de las hifas. Nuestro grupo de trabajo ha podido corroborar la actividad inhibitoria de la germinación de conidios e inhibición del crecimiento del micelio por parte de extractos vegetales, entre los que se destaca el de Larrea divaricata ?jarilla? (Hapon et al., 2011; 2012). Químicamente los extractos son matrices complejas y en el caso del último citado, forman parte de su composición una gran variedad de compuestos fenólicos. Entre ellos, los de mayor actividad biológica y cuantitativamente más importantes son el kaempferol, quercitina, ácido nordihidroguaiarético (NDGA) (Hyder et al., 2002). Estos compuestos poseen una gran capacidad antioxidante (Martins et al., 2012) además, ha sido reportado que el NDGA, entre otras propiedades, posee actividad antifúngica (Hwu et al., 2008). Adrian y colaboradores (1998) observaron cambios citológicos y ultraestructurales en conidios de B. cinerea tratados con compuestos fenólicos. Entre ellos mencionan la modificación de la permeabilidad de la membrana plasmática. Debido a que el extracto de jarilla posee un efecto fungitóxico, ya comprobado, hacia los conidios y el micelio de B. cinerea es que se hipotetiza que la sustancia afecta la ultraestructura celular del patógeno. Es por esto que el objetivo del trabajo fue evaluar los cambios citológicos inducidos por el tratamiento con extracto de jarilla sobre conidios y micelio de B. cinerea.   Materiales y Métodos El aislado de B. cinerea utilizado fue obtenido de vid. Luego de su aislamiento se obtuvo un cultivo monospórico. El extracto vegetal se realizó a partir de una infusión de hojas de L. divaricata que posteriormente fue concentrada por ebullición (Widmer & Laurent, 2006). La bioactividad del extracto sobre los conidios fue evaluada según Chilosi y colaboradores (2000) con algunas modificaciones. Se colocaron 2 mL de una suspensión de 1.106 esporas del patógeno a la que se le agregó 8 mL de la sustancia a estudiar. Ésta última consistió en el extracto diluido en agua destilada estéril en cantidad suficiente para alcanzar una concentración final de 5 y 15% y un testigo con sólo agua. Se realizaron tres réplicas técnicas por cada concentración. Luego de 10 horas de incubación, se prepararon los conidios para su observación tanto en microscopía electrónica de transmisión (MET) como barrido (MEB). El efecto del extracto sobre el crecimiento del micelio de B. cinerea se determinó haciendo crecer al hongo en un medio adicionado con la sustancia problema según la técnica descripta por Soliman y colaboradores (2002). El terreno agar papa glucosado (APG) semisólido fue mezclado con el extracto vegetal a las concentraciones 5; 15% y un testigo sin extracto y vertido en cajas de Petri estériles. Sobre el medio solidificado se sembró un disco de APG colonizado con el patógeno y se incubó a 21ºC por 4 días. Los conidios y el micelio fueron preparados para su observación por MEB. La fijación de la muestra se realizó en glutaraldehido al 3% en buffer fosfato. La deshidratación se llevó a cabo en concentraciones crecientes de acetona: agua destilada desde 30 al 100%. Por último se utilizó el aparato de punto crítico (Polaron, London UK) para retirar completamente la acetona presente en la muestra, y metalizarla (Metalizador Sputter coater Pelco 9100- USA). La observación se realizó con un microscopio marca ?LEO EVO 40 VP? con detector de electrones secundarios (Cambridge UK 2003). Los conidios fueron además observados por MET, para ello previamente, los conidios tratados fueron centrifugados y enjuagados. El pellet obtenido se fijó con glutaraldehido al 3% en buffer fosfato. Posteriormente se trató con Tetróxido de Osmio al 2% en agua. Para la deshidratación de la muestra se utilizaron concentraciones crecientes de etanol 30%, 50%, 80% y 100%. Posteriormente se trataron con acetona:etanol (50:50) y luego 100% de acetona. Finalmente se colocaron en una mezcla de acetona:resina (3:1), después 2:1 y resina pura. Para la polimerización se dejó toda la noche a 60ºC. El Ultramicrótomo (LKB Bromma 2088 ultrotome V) fue utilizado para obtener los cortes y estos colocados en grillas para realizar posteriormente el contraste con acetato de uranilo y citrato de plomo. La observación se realizó con un microscopio marca JEOL modelo JSM-100CX II. De las muestras obtenidas se evaluaron 30 estructuras presentes en cada repetición.   Resultados y Discusión Al examinar las imágenes obtenidas a partir del MEB se observaron cambios en la morfología externa de la pared de los conidios tratados con el extracto. Esta presentó una superficie rugosa consistente con una pared laxa y permeable además, en algunos casos se observó la plasmolización de la célula. Por otro lado los conidios no sometidos a la acción del extracto mostraron la pared celular con una superficie lisa. En el caso del micelio tratado con el extracto se observaron hifas deshidratadas (Fig. 1-A) mientras que en el testigo sin tratar las hifas se observaron normales bien tubulares y de paredes lisas (Fig 1-B). A partir de las imágenes obtenidas por MET pudo observarse en los conidios tratados, la presencia de una gran cantidad de vesículas y gránulos electrodensos además de una alteración de la membrana celular. Por otro lado, la pared celular se observó laxa lo cual indica un aumento de su permeabilidad (Fig.1-C). Todos estos cambios ultraestructurales además de ser considerados irreversibles causan la pérdida de viabilidad de la célula y por lo tanto de su capacidad de germinación. Esto se debe a que cambios en la permeabilidad de la membrana resulta en un desequilibrio en la presión osmótica intracelular, desorganización de las organelas, pérdida de citoplasma y la consecuente muerte celular indispensables para dilucidar el modo de acción del extracto de jarilla sobre la germinación de los conidios y la inhibición del crecimiento miceliar. Este tipo de cambios en la citología del microorganismo es considerado una ventaja al momento de intercalar productos fungicidas que tienen una acción monositio, evitando así la selección de cepas resistentes de B. cinerea.     C D A B Figura 1. Imágenes obtenidas de Microscopio electrónico de Barrido A y B dónde, A micelio testigo y B tratado con extracto de L. divaricata. Imágenes obtenidas de Microscopio electrónico de Transmisión C y D dónde, C conidio testigo y D conidio tratado con el extracto de L. divaricata