Expresión de antígenos del virus del dengue en cultivos vegetales

CAROLINA A. MARTÍNEZ; ANA M. GIULIETTI; JULIÁN RODRÍGUEZ TALOU

Buenos Aires. Argentina.

Congreso; XI Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial -JorFyBi 2007.; 2007

SAFyBI

Introducción: Las células vegetales como sistemas de expresión y producción de proteínas recombinantes, representan una alternativa dentro de los sistemas de expresión eucariota. El Dengue es una enfermedad emergente que afecta a países tropicales y subtropicales incluyendo a la Argentina. A pesar de los esfuerzos realizados para el desarrollo de una vacuna eficiente, ésta aún no se ha podido lograr. La expresión de antígenos virales en células vegetales es una alternativa viable y económica para las regiones en las cuales la enfermedad se extiende. Dentro de las proteínas estructurales  del genoma del virus del dengue, la proteína E es la que mayor inmunogenicidad produce (Kelly E. et al., 2000). Necesita ser N-glicosilada en Asn67 y Asn153 para su correcto plegamiento y para la morfogénesis viral en células humanas. Para ello, debe ser direccionada a la vía secretoria con una secuencia señal en su extremo amino-terminal. La presencia de una secuencia de retención en  retículo endoplasmático en el extremo carboxilo-terminal de algunas proteínas recombinantes incrementa los niveles de producción de las mismas (Hellwig S., 2004). El objetivo de este trabajo fue construir distintos cassettes de expresión de la proteína E del virus del Dengue para ser expresados en cultivos vegetales para la potencial producción de una vacuna eficiente. Materiales y Métodos: El plásmido que codifica para la proteína E (pMT/V5-HisA C-prM-E/DV) fue gentilmente cedido por la Dra. A. Gamarnik y el péptido señal (GRP, Glycine-Rich Protein) se obtuvo del plásmido comercial pCAMBIA1305.2. El promotor CaMV35S constitutivo y fuerte se obtuvo del plásmido pMOG 843. La construcción de los cassettes de expresión CaMV35S-GRP-E-KDEL-stop y CaMV35S-GRP-E-stop se realizó a partir de estos plásmidos realizando cuatro PCR consecutivas y utilizando primers especialmente diseñados para este fin. En una primera instancia se clonó la secuencia GRP río arriba de la proteína E en cada construcción. La secuencia de retención KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) y dos codones STOP en tandem fueron introducidos con primers río abajo de la proteína E en la construcción correspondiente. En una segunda etapa, se introdujo el promotor vegetal constitutivo y fuerte CaMV35S río arriba  de las construcciones anteriores. Previamente, tanto proteína E, como GRP y  promotor  fueron clonados en pGEM T Easy Vector (Promega) y secuenciados (Macrogen, Corea). Resultados: A través de la aplicación del clonado por PCR se obtuvo primero la construcción GRP-E-KDEL y GRP-E que están constituidas por el péptido señal GRP y la proteína E lo cual se confirmó por secuenciación bidireccional. Estas construcciones difieren únicamente en la presencia de la secuencia KDEL. En una segunda etapa se incorporó río arriba de las construcciones antes mencionadas el promotor vegetal CaMV35S previo clonado en pGEMT Easy Vector y posterior secuenciación. Actualmente se está ensayando la incorporación del terminador PotPIt (Potato Protease Inhibitor terminador) río abajo de ambas construcciones. Conclusiones: A través del diseño propuesto para la construcción del cassette de expresión de la proteína E se logró introducir el péptido señal GRP en el extremo N-terminal de la secuencia que codifica para la proteína E y la secuencia KDEL en el C-terminal. También se introdujeron dos codones STOP y diversos sitios de restricción para el clonado que estamos efectuando actualmente. Finalmente se introdujo el promotor vegetal CaMV35S que garantiza una alta tasa de expresión de la proteína recombinante. La elección de las secuencias regulatorias para la funcionalidad y niveles óptimos de expresión son esenciales en el diseño de construcciones genéticas para la expresión de proteínas foráneas.