Remoción in situ de proteína recombinante en cultivo de Pichia pastoris

CEREZO J; SMITH ME; RODRÍGUEZ TALOU J

Bahía Blanca

Simposio; XI REDBIO 2017; 2017

REDBIO

El objetivo del presente trabajo es presentar una estrategia integrada producción, purificación e inmovilización de un antígeno del virus del Dengue (VD) para el diseño de un kit diagnóstico. Para esto se expresó el dominio III consenso de la proteína E del VD fusionado a hidrofobinas para su purificación en sistemas de dos fases acuosas e inmovilización directa por adsorción del producto purificado en placas multiwell usadas normalmente en técnicas de ELISA. La estrategia integrada se mejoró por la remoción in situ de la proteína de fusión durante el proceso de cultivo de la levadura, Pichia pastoris. El Dominio III consenso ha sido descripto recientemente basándose en el DomIII de la proteína E de distintas variedades de cada serotipo de todo el mundo, la cual demostró capacidad de generar una respuesta inmune contra todos los serotipos, por lo que es candidata a ser un antígeno vacunal contra el virus del dengue.Las hidrofobinas son proteínas anfifílicas de entre 7,5 ? 10 kDa, producidas por hongos filamentosos. Se ha observado que las proteínas fusionadas a ellas cambian su grado de hidrofobicidad y pueden ser separadas fácilmente en sistemas de dos fases acuosas, principalmente en aquellos basados en surfactantes no-iónicos.Para la expresión de la proteína se utilizó la cepa Pichia pastoris cepa X-33, y el plásmido PICZa. En este plásmido la proteína de interés se expresa fusionada en el N-terminal con la secuencia alfa del factor de secreción de Saccharomyces cerevisiae, favoreciendo la liberación de la proteína heteróloga al medio de cultivo. La transformación y expresión se llevó a cabo según el manual del fabricante. Se detectó la presencia de la proteína heteróloga en el sobrenadante de cultivo. Se llevó a cabo la purificación mediante dos fases acuosas ex situ para determinar la concentración óptima a utilizar de surfactante no-iónico. Para ello, a los sobrenadantes de cultivo se les agregó Triton X-114 en una concentración final del 2%, 4% y 8%. Luego de la separación de fases, a la fase con detergente se le agregó isobutanol para recuperar la proteína. Tras esta segunda separación de fases, se obtuvo una segunda fase acuosa donde se observó la proteína purificada. Se obtuvo con mayor rendimiento bajo la condición de un 2% de Triton X-114. Luego se realizó la expresión de la proteína heteróloga en presencia del surfactante no-iónico al 2% en el proceso de fermentación. Se cosechó la fase detergente y se continuó con la metodología de las dos fases acuosas. Las diferentes fases fueron analizadas, y en la segunda fase acuosa se observó la presencia de la proteína heteróloga. Siendo esta estrategia de remoción in situ aplicable a este sistema.La optimización propuesta del proceso de downstream resulta una estrategia económica, que disminuye los tiempos de proceso, y de fácil escalado, siendo una estrategia atractiva para la purificación de otras proteínas recombinantes.