Expresión de DXS en cultivos celulares de Morinda citrifollia para incrementar la producción de metabolitos secundarios

QUEVEDO CARLA, ,; GIULIETTI A. M; RODRIGUEZ TALOU J.

Buenos Aires. Argentina

Congreso; XI Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial -JorFyBi 2007,; 2007

SAFyBI

INTRODUCCION  Los cultivos celulares vegetales representan una alternativa para la producción a gran escala de productos naturales de interés farmacéutico. Morinda citrifolia produce  antraquinonas (AQs) que son metabolitos con gran potencial terapéutico: antifúngico, antileucémico, analgésico, entre otros. Las AQs están formadas por tres anillos: los anillos A y B son derivados del acido chorísmico y del á-cetoglutarato vía O-acido succinilbenzoico (OSB), y el anillo C es formado del isopentenil di fosfato (IPP) via de los terpenos. En plantas superiores, hay dos vías metabólicas que dan lugar a su formación: la vía del Acetato/Mevalonato (MVA), citoplasmática y común en todos los organismos vivos y la vía metabólica MEP (2-C methyl-D- erythritol 4-phosphate), que se produce en plástidos; ambas vías producen IPP, usado para la biosíntesis del anillo C. El IPP es formado de acetil CoA por la vía MVA y por condensación del gliceraldehído 3 fosfato (GAP) y piruvato en la vía del MEP catalizada por 1-deoxy-D-xylulose 5-fosfato sintasa (DXS) dando lugar a la formación de 1-deoxy-D-xylulose 5-fosfato, siendo un  paso importante en la via del MEP. Se sabe que la sobreexpresión de DXS produce una mayor acumulación de terpenos, siendo una enzima clave en la regulación de dicha vía. El objetivo de este trabajo es incrementar la producción de AQs por sobreexpresión de DXS en cultivos celulares de M. Citrifolia, mediante la construcción de un vector de expresión con DXS y estudiar su efecto sobre el metabolismo secundario. MATERIALES Y METODOS El cDNA de DXS de C. roseus clonado en el vector pGem T Easy Vector se aisló y clonó en el vector pMOG 843, entre el promotor 35S del virus mosaico del coliflor (CaMV-35S) y el terminador del inhibidor de proteasas de papa (PIt). El gen reportero de la β-glucuronidasa (GUS) se clonó en el vector pMOG 22 (pMOG22-GUS). A partir del pMOG 843, se obtuvo la construcción genómica y se clonó en pMOG22-GUS. Los clones positivos para la construcción se introdujeron por mating tri-parental en la cepa hipervirulenta de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404  GN54D. Para la transformación se usaron suspensiones celulares de M. citrifolia de 3-4 días de edad cultivadas a 25ºC con fotoperíodo de 16 hs. La cepa de A. tumefaciens con pMOG22-GUS dxs se cultivó en medio AB líquido con los antibióticos correspondientes a 28ºC durante 72 hs. Se mezcló 1 volumen de cultivo bacteriano a diferentes DO 600 nm: 0.25, 0.5 y 1 con 9 volúmenes de células vegetales y se colocaron en placas con medio de co-cultivación e incubadas 72 hs a 24ºC en oscuridad. Realizado esto las células fueron recolectadas, lavadas y transferidas en medio selectivo e incubadas a 24ºC. La transformación fue chequeada analizando la expresión del gen GUS. RESULTADOS Se logró la construcción de un vector de expresión binario el cual contiene al gen dxs (pMOG22-GUS DXS), dicho vector posee como características principales el gen con resistencia higrocimicina, el gen reporter b-glucuronidasa clonado entre el promotor de CaMV-35S y el terminador de la nopalina-sintasa (nos) y los bordes izquierdos y derechos de T-DNA de A. tumefaciens. La construcción obtenida fue introducida por transformación mediada por A. tumefaciens en suspensiones celulares de M. citrifollia con el objetivo de aumentar la producción de las AQs. CONCLUSIONES Se obtuvo un vector de expresión de la enzima DXS el cual puede ser utilizado tanto en M. citrifollia como en todas las plantas superiores  y estudiar su efecto en la producción de metabolitos secundarios.