TRANSPORTE DE GLICEROL POR PEDIOCOCCUS DE VINO

SERGIO ENRIQUE PASTERIS; SAAD, A. M. S.

Tafi del Valle-Tucuman

Congreso; XX JORNADAS DE LA ASOCIACION DE BIOLOGIA DE TUCUMAN; 2003

Glicerol atraviesa las membranas biológicas por difusión pasiva debido a su naturaleza lipofílica. Además, proteínas transportadoras específicas (permeasas) son sintetizadas por los microorganismos para incrementar la captación. La difusión facilitada es el mecanismo mayormente descrito para el transporte de glicerol en bacterias de la familia Enterobacteriaceae y en algunas especies de Pseudomonas, Bacillus y Enterococcus. Sin embargo, algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa utilizan un mecanismo de transporte activo. Pediococcus pentosaceus N5p, aislada de vino argentino, degrada glicerol principalmente por el camino de la glicerol kinasa y por la vía de la glicerol dehidrogenasa. Las enzimas de ambos caminos metabólicos se encuentran reguladas por concentración de glicerol y disponibilidad de oxígeno. Los productos formados están relacionados al metabolismo de piruvato. En este trabajo estudiamos el mecanismo involucrado en la incorporación de glicerol en Pediococcus pentosaceus N5p. Las cepas de Pediococcus pentosaceus N5p y E3p fueron crecidas en medio MRS modificado adicionado con glicerol o glucosa 5,5 mM, en aerobiosis y a 30°C. Las células no proliferantes se prepararon en diferentes concentraciones de soluciones tampones Tris-HCl, HA-acetato, ácido cítrico-citrato, KH2PO4-K2HPO4 a distintos valores de pH. El consumo de glicerol se determinó por método enzimático. Se utilizaron diferentes concentraciones de 2-3+H glicerol. Los inhibidores metabólicos se adicionaron en concentraciones de 1 y 10 mM.  La depleción energética celular se realizó por agitación, 3 horas o por tratamiento con ácido iodoacético 1mM (IAA), 30 minutos. Pediococcus pentosaceus N5p utiliza glicerol en un sistema de células no proliferantes, obteniéndose los mayores valores de utilización en solución tampón Tris-HCl 10 mM, pH 7,0. La captación de 2 3+H glicerol exhibió una cinética de saturación, con un Km=33 mM y Vmax= 0,8 nmoles/min/mg proteína. La cepa E3p no capta glicerol en relación a su incapacidad para utilizar este sustrato. La ausencia de inhibición en la captación de glicerol en la cepa N5p por NaF, descarta la implicancia del sistema PEP-PTS. La incorporación de glicerol  marcado no tubo variaciones significativas cuando la cepa crece en glucosa o glicerol, indicando una posible naturaleza constitutiva del transportador. La adición de D-glucosa 75 mM a células crecidas en glicerol y ayunadas, restauró en un 100% la captación de glicerol pero no tubo efecto en células sin ayunar. Estos resultados otorgan evidencia preliminar que el transporte de glicerol es dependiente de energía. Se detectó una marcada inhibición del transporte de glicerol por NaCN (49.7%), IAA (97.3%), 2,4-DNP (100%), DCCD (81%) y por protonóforos como CCCP (60.7%) y valinomicina (100%). Cuando las células fueron de-energizadas con IAA y tratadas con CCCP 10 mM, se produjo un 50% de reactivación del transporte de glicerol. En base a las inhibiciones por IAA, DNP y CN-, concluimos que el transporte de glicerol requiere energía en forma de ATP. La inhibición por DCCD, indica que en el mecanismo está involucrada una ATPasa de membrana. Los resultados obtenidos con CCCP y valinomicina, así como la restauración del transporte por CCCP en células ayunadas, demuestran que el transporte es dependiente de fuerza protomotriz (FMP). El requerimiento de ATP, ATPasa y FMP es característico del transporte activo secundario mediado por permeasa, mecanismo que proponemos para el transporte de glicerol por Pediococcus pentosaceus N5p.