rhGM-CSF: clonado, cuantificación y purificación a partir de cultivos celulares

FORNO, A. G.; DEPETRIS, M.; OGGERO EBERHARDT, M.; BOLLATI FOGOLÍN M. R.; KRATJE, R. B.; ETCHEVERRIGARAY, M.

Santa Fe. Pcia. Santa Fe. Argentina

Congreso; XXIV Congreso Argentino de Química; 2002

Asociación Química Argentina – Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral

El Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos humano (hGM CSF) es una glicoproteína que regula la proliferación y diferenciación de precursores celulares hematopoyéticos. Su administración como medicamento ha demostrado ser eficaz para revertir o prevenir leucopenias resultantes de la toxicidad de ciertas drogas como las empleadas en el tratamiento de enfermedades tumorales. En el presente trabajo se describen las etapas desarrolladas para la obtención de hGM-CSF recombinante (rhGM-CSF). Se clonaron líneas de células adherentes CHO.K1 (Chinese Hamster Ovary) previamente transfectadas con los plásmidos de expresión pCI-Neo-GM-8 (línea 1p8B5) y pk G4 GM-15 (línea 2pk15A1). Los clones resultantes se estudiaron con el fin de caracterizar los parámetros de producción y crecimiento celular. Finalmente, debido a su mayor productividad y actividad específica, el clon 2G6 fue seleccionado para la producción de rhGM-CSF. Para la cuantificación de rhGM-CSF en las distintas etapas del proceso biotecnológico involucrado en su producción, se desarrolló un ELISA basado en la competición entre rhGM-CSF inmovilizado en fase sólida y la citoquina soluble, por su unión con un anticuerpo en solución. Para ello se obtuvo un panel de anticuerpos monoclonales (MAbs) empleando GM-CSF no glicosilado como inmunógeno. El panel constituido por 7 anticuerpos monoclonales fue caracterizado desde el punto de vista inmunoquímico con el objeto de seleccionar aquellos anticuerpos más apropiados para el desarrollo del ensayo inmunoenzimático. Se seleccionó el MAb M7E10 debido a su mayor capacidad para el reconocimiento de la citoquina nativa independientemente de su grado de glicosilación. Este ensayo demostró un límite de detección de 780 pg/ml con una recuperación del 86,6%. Por otra parte, los MAbs M7E10 y M1B8 previamente caracterizados fueron purificados a partir de fluido ascítico para la posterior preparación de matrices de inmunoafinidad a ser utilizadas en la purificación de la citoquina. El rhGM-CSF fue purificado a partir de sobrenadante de cultivo del clon 2G6 suplementado con 0,1% de SFB. Los resultados de la purificación se analizaron por SDS-PAGE y Western Blot con el MAb CC1H7, para evaluar la heterogeneidad en la población de isoformas obtenidas, ya que este anticuerpo reconoce todas las isoformas producidas. El MAb M7E10 permitió purificar todas las isoformas de rhGM-CSF producidas por las células recombinantes, mientras que con el MAb M1B8 las isoformas de mayor peso molecular son retenidas con menor afinidad, eliminándose durante los lavados previos a la elución de la citoquina, lo que probablemente se deba a la menor afinidad que presenta este anticuerpo por la molécula de rhGM-CSF. Como segunda etapa de purificación se utilizó la cromatografía de tamices moleculares. Se realizaron determinaciones analíticas para evaluar el proceso de purificación tales como PAGE-SDS, realizando diluciones sucesivas 1:5 con tinción argéntica, obteniéndose una pureza superior al 99%.