Cuantificación de rhEPO mediante un ELISA sandwich en diferentes estadios del proceso productivo

AMADEO, G.; ZENCLUSSEN, M. L.; OGGERO EBERHARDT, M.; KRATJE, R. B.; ETCHEVERRIGARAY, M.

Santa Fe. Pcia. Santa Fe. Argentina

Congreso; XXIV Congreso Argentino de Química.; 2002

Asociación Química Argentina – Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral

La eritropoyetina es una hormona producida fundamentalmente por el riñón, responsable de la producción de eritrocitos. La producción de esta proteína por técnicas de ADN recombinante ha hecho posible su empleo como agente terapéutico para diversas enfermedades humanas, particularmente la anemia asociada a insuficiencia renal crónica. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar enzimoinmunoensayos basados en anticuerpos monoclonales (MAb) para la adecuada cuantificación de rhEPO tanto en los diferentes estadios del proceso de producción como en el producto final. Con este fin, 5 clones productores de MAbs anti-EPO, producidos previamente en el laboratorio, fueron cultivados en frascos T de 75 cm2. Asimismo fueron inyectados en ratones a fin de producir líquido ascítico. Los MAbs (2B2, 2G10, 2G6, 1E3 y 3H7) fueron purificados a partir de los sobrenadantes de cultivos y ascitis por cromatografía de afinidad a proteína A y caracterizados inmunoquímicamente en cuanto a su capacidad de reconocimiento de la hormona. Mediante técnicas de SDS-PAGE nativo y desnaturalizante, isoelectroenfoque, Western Blot y determinación de la constante de afinidad se seleccionaron los anticuerpos monoclonales 2B2 y 2G10 como candidatos para el diseño de un ELISA sandwich indirecto. Se realizó un screening utilizando estas dos inmunoglobulinas monoclonales como anticuerpos de captura y suero de conejo anti-EPO como segundo anticuerpo. Se reveló la reacción mediante un anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa. Se estudió el reconocimiento de la glicoproteína parcial y totalmente deglicosilada. Los resultados demostraron que sólo el MAb 2B2 es capaz de unirse de manera específica a todas las isoformas de rhEPO presentes en las muestras y el material de referencia. La sensibilidad del ensayo fue de 30 ng/ml para la máxima masa de anticuerpo adsorbido (400 ng/pozo). Se comprobó que el ELISA es adecuado para la cuantificación de rhEPO en las distintas etapas del proceso productivo así como también en diferentes formulaciones finales.