Producción y purificación de rhGM-CSF en células recombinantes de mamífero

FORNO, A. G.; DEPETRIS, M.; OGGERO EBERHARDT, M.; BOLLATI FOGOLÍN M. R.; KRATJE, R. B.; ETCHEVERRIGARAY, M.

Buenos Aires. Argentina

Congreso; IX Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2002

Asociación Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial

Introducción: El Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos humano (hGM CSF) es una glicoproteína que regula la proliferación y diferenciación de precursores celulares hematopoyéticos. Su administración como medicamento ha demostrado ser eficaz para revertir o prevenir leucopenias resultantes de la toxicidad de ciertas drogas como las empleadas en el tratamiento de enfermedades tumorales. Objetivos: i) Desarrollar un ensayo para la cuantificación de rhGM-CSF; ii) Seleccionar clones celulares adecuados para su producción, y iii) Diseñar una estrategia para la purificación de esta proteína recombinante. Materiales y Métodos: Para la cuantificación de rhGM-CSF en las distintas etapas del proceso biotecnológico involucrado en su producción, se desarrolló un ELISA basado en la competición entre rhGM-CSF inmovilizado en fase sólida y la citoquina soluble, por su unión con un anticuerpo en solución. Para ello se obtuvo un panel de anticuerpos monoclonales (MAbs) empleando GM CSF no glicosilado como inmunógeno. El panel constituido por 7 anticuerpos monoclonales fue caracterizado mediante técnicas de SDS-PAGE nativo y desnaturalizado y se determinaron las constantes de afinidad por ELISA con el objeto de seleccionar aquellos anticuerpos más apropiados para el desarrollo del ensayo inmunoenzimático. Líneas de células adherentes CHO.K1 (Chinese Hamster Ovary) previamente transfectadas con los plásmidos de expresión pCI-Neo-GM-8 (línea 1p8B5) y pk G4 GM-15 (línea 2pk15A1) se clonaron por el método de dilución límite. Se estudiaron las variables de crecimiento y producción de los clones obtenidos. Posteriormente, los clones seleccionados se cultivaron en diferentes condiciones con respecto a la suplementación con suero fetal bovino (SFB) y las proteínas recombinantes producidas se analizaron por técnicas de Western blot y ensayos de valoración de la actividad biológica in vitro. Los MAbs M7E10 y M1B8, previamente purificados a partir de fluido ascítico por cromatografía de afinidad a proteína A, fueron empleados para la preparación de matrices de inmunoafinidad a ser utilizadas en la purificación de la citoquina. El rhGM-CSF fue purificado a partir de sobrenadante de cultivo del clon 2G6 suplementado con 0,1% de SFB. Los resultados de la purificación se analizaron por SDS-PAGE y Western Blot con el MAb CC1H7. La elección de este último anticuerpo se basó en el hecho de que al reconocer todas las isoformas de rhGM-CSF es adecuado para evaluar la heterogeneidad de la población de isoformas obtenidas. Resultados y Conclusiones: Para el ELISA se seleccionó el MAb M7E10 debido a su mayor capacidad para el reconocimiento de la citoquina nativa, independientemente de su grado de glicosilación. Este ensayo demostró un límite de detección de 780 pg/ml, con una recuperación del 86,6%. Un clon representativo de cada línea fue seleccionado teniendo en cuenta los parámetros de producción y crecimiento de los mismos: el clon 2G6 proveniente de la línea 1p8B5 (producción acumulada: 2,9 g/ml), y el clon 2A3 proveniente de la línea 2pk15A1 (producción acumulada: 2,0 g/ml). Finalmente, debido a su mayor productividad y actividad biológica específica, el clon 2G6 fue seleccionado para la producción de rhGM-CSF. La cromatografía de afinidad empleando el MAb M7E10 permitió purificar todas las isoformas de rhGM-CSF producidas por las células recombinantes. En cambio, empleando el MAb M1B8, las isoformas de mayor peso molecular son retenidas con menor afinidad, eliminándose durante los lavados previos a la elución de la citoquina, lo que probablemente se deba a la menor afinidad que presenta este anticuerpo por la molécula de rhGM-CSF.