Producción de rhEPO: su cuantificación mediante un ELISA sandwich en el cultivo, la purificación y en el producto final

DIDIER, C.; AMADEO, G.; ZENCLUSSEN, M. L.; OGGERO EBERHARDT, M.; ETCHEVERRIGARAY, M.; KRATJE, R. B.

Buenos Aires. Argentina

Congreso; IX Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2002

Asociación Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial

Introducción: La eritropoyetina es una hormona producida fundamentalmente por el riñón, responsable de la producción de eritrocitos. La proteína recombinante producida en células animales se emplea como agente terapéutico, especialmente en la anemia asociada a insuficiencia renal crónica. Objetivos: i) Obtener nuevas líneas celulares con elevados niveles de productividad para rhEPO, y ii) Desarrollar enzimoinmunoensayos basados en anticuerpos monoclonales (MAb) para la adecuada cuantificación de rhEPO tanto en los diferentes estadios del proceso de producción como en el producto final. Materiales y Métodos: Las líneas celulares recombinantes productoras de rhEPO se cultivaron en adherencia en medio de cultivo suplementado con suero fetal bovino (SFB). La productividad celular se determinó de la siguiente manera: se cultivaron las células hasta llegar a confluencia y se retiró el sobrenadante de cultivo, reemplazándolo por medio fresco al 0,1% SFB. A las 72 hs se cuantificó la rhEPO producida y se realizó el recuento celular. El clonado de las líneas se llevó a cabo por el método de dilución límite en placas de 96 pozos. El screening de clones se realizó por inmunodot. Para la determinación de las concentraciones de glucosa y lactato en sobrenadantes de cultivo se empleó un autoanalizador (YSI, USA). La determinación de amonio se realizó por una técnica colorimétrica. La caracterización de la molécula de rhEPO producida se realizó por SDS-PAGE, isoelectroenfoque y Western blot de los sobrenadantes de cultivo. Con el objeto de llevar a cabo el segundo objetivo, 5 clones productores de MAbs anti-EPO, obtenidos previamente en el laboratorio, fueron cultivados en frascos T de 75 cm2. Los MAbs (2B2, 2G10, 2G6, 1E3 y 3H7) fueron purificados a partir de los sobrenadantes de cultivos y/o ascitis por cromatografía de afinidad a proteína A y caracterizados inmunoquímicamente en cuanto a su capacidad de reconocimiento de la hormona. En base a los resultados obtenidos mediante técnicas de PAGE nativo y desnaturalizante, isoelectroenfoque, Western Blot y determinación de la constante de afinidad se seleccionaron los anticuerpos monoclonales 2B2 y 2G10 como candidatos para el diseño de un ELISA sandwich indirecto. Se realizó un screening utilizando estas dos inmunoglobulinas monoclonales como anticuerpos de captura y suero de conejo anti-EPO como segundo anticuerpo. Se reveló la reacción mediante anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa. Resultados y Conclusiones: Se seleccionaron 6 clones en base a su productividad, adaptándolos a crecer en medio al 2% de SFB. El clon C4H8 resultó el mejor productor, considerando la cantidad de hormona secretada así como el patrón de isoformas producidas. Los resultados del ELISA demostraron que sólo el MAb 2B2 es capaz de unirse de manera específica a todas las isoformas de rhEPO presentes en las muestras y el material de referencia. La sensibilidad del ensayo fue de 30 ng/ml para la máxima masa de anticuerpo adsorbido (400 ng/pozo). Se comprobó que el ELISA es adecuado para la cuantificación de rhEPO en las distintas etapas del proceso productivo así como en las formulaciones finales.