Desarrollo de métodos de cuantificación de GM-CSF humano recombinante

BOLLATI FOGOLÍN M. R.; OGGERO EBERHARDT, M.; KRATJE, R. B.; ETCHEVERRIGARAY, M.

Santa Fe. Pcia. Santa Fe. Argentina

Jornada; II Encuentro de Jóvenes Investigadores de la Universidad Nacional del Litoral; 1998

Secretaría de Bienestar Universitario y Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional del Litoral; Federación Universitaria del Litoral

El Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos (GM-CSF) es una glicoproteína que activa el crecimiento y diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas, ampliamente empleado para revertir o prevenir leucopenias secundarias a la quimioterapia. Esta citoquina fue expresada en diferentes sistemas huésped: bacterias, levaduras y células de mamífero, presentando todos ellos actividad biológica. Sin embargo, ha sido informado que pacientes sometidos a tratamiento con GM-CSF humano recombinante producido en levaduras y E. coli desarrollan respuestas desfavorables que se traducen en la producción de anticuerpos que inevitablemente desencadenan la ineficacia del tratamiento. Estas razones justifican la elección de las células de mamífero para su producción, a pesar de los bajos niveles de expresión logrados. En el presente trabajo se compararon diferentes técnicas desarrolladas en el laboratorio con el objeto de determinar su concentración en los procesos biotecnológicos utilizados para su producción. Con este fin, se desarrollaron, por un lado, métodos inmunoquímicos (inmunodot y ELISA) y por otro, técnicas que permiten su cuantificación evaluando además su efecto biológico sobre una línea celular, cuyo crecimiento es completamente dependiente de esta citoquina. Se prepararon anticuerpos monoclonales murinos (MAb) y anticuerpos policlonales por inmunización de conejos. El GM-CSF aglicosilado fue empleado como inmunógeno en ambos procedimientos. Para el ensayo de inmunodot se inmovilizó sobre nitrocelulosa GM-CSF, incubándose alternativamente con los MAb 7E10 y 1B8, el suero policlonal o el MAb 1B8 biotinilado. Se desarrollaron dos sistemas de ELISA: ELISA competitivo y ELISA sandwich. En el primero se realizó la competición entre el GM-CSF de la muestra en solución y el estándar inmovilizado en fase sólida, por el MAb 7E10 en solución. Para el ELISA sandwich se inmovilizó MAb 1B8. Luego de incubar con el GM-CSF presente en la muestra, se empleó el suero policlonal como segundo anticuerpo. La valoración de la actividad biológica in vitro del GM-CSF glicosilado y aglicosilado se realizó evaluando la proliferación de la línea celular TF-. El ensayo de valoración biológica del GM-CSF demostró mayor sensibilidad para esta determinación (0,02 ng/ml). Sin embargo, dado que el ELISA sandwich combina una mayor simplicidad metodológica con una muy buena sensibilidad (0,78 ng/ml), resultó ser el más apropiado para su cuantificación en el proceso biotecnológico mencionado. Los ensayos de inmunodot son de rápida ejecución pero su sensibilidad es considerablemente más baja (60-500 ng/ml).