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Introducción: En nuestro laboratorio, el proceso de producción, purificación y análisis de rhEPO requiere el empleo de un anticuerpo monoclonal anti-rhEPO (mAb 2B2) para su aplicación en distintos procedimientos: cromatografía de inmunoafinidad, western blot y ELISA para determinaciones cuali- y cuantitativa, respectivamente. Hasta el momento, el mAb 2B2, desarrollado en nuestro laboratorio, era producido in vivo en líquido ascítico, mediante el empleo de animales de experimentación, dado que ésta constituye una forma rápida de obtener cantidades suficientes de anticuerpos para afrontar los procedimientos antes mencionado. Sin embargo, debido a las preocupaciones éticas, científicas y de seguridad inherentes al uso de animales hemos asumido, el compromiso de disminuir el desarrollo de actividades relacionadas con los mismos. Por ello, decidimos proveernos de mAbs de manera continua y en grandes cantidades prescindiendo del uso de animales y sus derivados. En este sentido, se procedió a la adaptación del cultivo in vitro del hibridoma 2B2 a un medio libre del empleo de suero fetal bovino (SFB) para su producción a mayor escala.Materiales y Métodos: El proceso de adaptación consistió en la reducción gradual de la concentración de SFB en el medio de cultivo de los hibridomas (DMEM), desde 20% (V/V) hasta 1,25% (V/V). Una vez adaptados a esta última condición, se continuó con dos protocolos:1.Adaptación directa a un medio libre de SFB empleando una mezcla de medios comerciales suplementado con lípidos (necesarios dada la condición auxótrofa de los hibridomas para los lípidos). Para ello, se reemplazó el medio de cultivo conteniendo SFB por medio libre de suero. 2.Adaptación secuencial, donde el recambio del medio se hizo de manera gradual respetando las proporciones 75:25, 50:50, 25:75, 0:100 de los reactivos: SFB 1,25% (V/V):medio libre de SFB. El proceso de adaptación de los hibridomas fue monitoreado diariamente, cuantificando la densidad celular, la viabilidad y la producción acumulada de mAb, útiles para calcular la velocidad específica de crecimiento (μ) y muerte (vm), y la productividad (ρ) alcanzada en cada etapa de adaptación. Además, se estimó la afinidad aparente del anticuerpo producido por los hibridomas en cada condición.Resultados: En todas las condiciones evaluadas se observó una fase de adaptación al nuevo medio de cultivo (fase lag) de aproximadamente 24 h. Los hibridomas adaptados a las condiciones de SFB 20% (V/V), 10% (V/V) y de medio libre de suero, presentaron una fase exponencial más breve, alcanzando el máximo de densidad celular a las 72 h de iniciado el cultivo. Las restantes condiciones alcanzaron su máximo celular a las 96 h de iniciado el cultivo. La viabilidad celular evidenció un comportamiento similar para todas las condiciones ensayadas. El análisis de la producción acumulada de mAb 2B2 permitió distinguir tres grupos: uno compuesto por las condiciones con mayor concentración de SFB (20%, 10% y 5%) y los hibridomas adaptados directamente al medio libre de SFB, los cuales alcanzaron una producción acumulada de aproximadamente 50 μg/mL; un segundo grupo compuesto por los hibridomas adaptados a condiciones de cultivo con bajas concentraciones de SFB (2,5% y 1,25%), los cuales alcanzaron una producción acumulada menor (15-20 μg/mL); y el tercer grupo contempla al proceso de adaptación secuencial, el que por motivos que se desconocen, mostró una notable disminución en la producción de mAb 2B2 (menor de 5 μg/mL).El procedimiento de adaptación, en general, condujo a una disminución en la velocidad de crecimiento de los hibridomas, lo que se tradujo en tiempos de duplicación que oscilaron entre 15 y 12 h para el cultivo en presencia de SFB 20% (V/V) y el de adaptación directa al crecimiento en medio libre de SFB, respectivamente. Del mismo modo, se observó un incremento en la velocidad de muerte en aquellos cultivos en presencia de bajas concentraciones de SFB, indicando que el mismo es un reactivo limitante para el sostenimiento de la viabilidad del cultivo. Contrariamente, la adaptación gradual ocasionó un descenso importante de dicha velocidad, o la llevó a un valor intermedio para el cultivo adaptado en forma directa al crecimiento en ausencia de SFB, indicando que el cambio de suero por dicho reactivo fue capaz de sostener la viabilidad del cultivo luego de alcanzar la fase de muerte del mismo. Asimismo, se visualizó una mayor productividad para el cultivo sometido a crecimiento con SFB 20% (V/V), la cual descendió en un 34% para el cultivo adaptado en forma directa al medio libre de SFB, en contraposición con un descenso del 97% para la adaptación gradual. Este último perdió la capacidad de expresar el mAb probablemente por un proceso de selección clonal durante su adaptación. Finalmente, no se observaron diferencias en las constantes de afinidad aparente de los mAbs provenientes de las distintas condiciones del cultivo, aunque no fue posible determinar la correspondiente al cultivo adaptado en forma gradual, dadas las insignificantes concentraciones de mAb alcanzadas (Tabla 1).Conclusión: Los procesos de adaptación de células de mamífero, particularmente el de hibridomas a un medio libre de SFB, muchas veces implican pérdidas en la expresión de la proteína de interés. Sin embargo, en este trabajo, el protocolo de adaptación directa permitió conservar una elevada productividad del mAb (8,04 pg cel-1 día-1) con una constante de afinidad aparente adecuada para la preparación de matrices cromatográficas de inmunoafinidad (5,6×108 M-1). Al mismo tiempo, dicha adaptación permitió prescindir del uso de animales para la producción del reactivo y la disminución de los costos de producción del mismo al eliminar el SFB del medio de cultivo.

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