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Introducción: La baja estabilidad y corta vida media en circulación que presentan las proteínas recombinantes terapéuticas desarrolladas como biofármacos de primera generación constituyen los mayores obstáculos para sus aplicaciones clínicas. Por tal motivo, se han implementado estrategias con el fin de prolongar su tiempo de permanencia en circulación en un contexto de dosis terapéuticas adecuadas. La glicosilación es el evento co/postraduccional más importante que llevan a cabo las células eucariotas y, por este motivo, se ha propuesto a la glicoingeniería como un área de gran interés tecnológico cuyo objetivo es conferir a las proteínas mejoras en sus propiedades: solubilidad, bioactividad, secreción, velocidad de depuración plasmática y antigenicidad, entre otras. El objetivo de este trabajo fue la evaluación de una estrategia de O-glicoingeniería para la generación de variantes recombinantes de IFN-α2b humano (hIFN-α2b) con potencial uso terapéutico. Dicha estrategia consistió en la adición de una nueva etiqueta peptídica (mGMOP), derivada del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos humano (hGM-CSF), la cual consta de los primeros 7 aminoácidos de la región N‑terminal del hGM-CSF conteniendo 8 residuos adicionales que confieren 6 sitios potenciales de O‑glicosilación. Las proteínas quiméricas resultantes de la fusión entre una proteína de interés farmacéutico como hIFN-α2b y el péptido mGMOP (utilizado en diferentes proporciones con respecto a la citoquina) fueron producidas en células CHO-K1, purificadas y caracterizadas desde el punto de vista fisicoquímico y biológico.Materiales y Métodos: Las quimeras mGMOP/IFN fueron producidas a partir de líneas celulares recombinantes de CHO-K1 cultivadas en condiciones de adherencia. La cuantificación de IFN en las cosechas de sobrenadante de cultivo se realizó mediante un ELISA sándwich indirecto. Las variantes de IFN fueron purificadas a partir de dichas cosechas empleando un anticuerpo monoclonal (mAb CA5E6) anti-hIFN-α2b acoplado a una matriz de Sepharose 4B activada con CNBr. Las recuperaciones alcanzadas fueron calculadas mediante el ELISA previamente mencionado. Los perfiles de masa molecular y de carga de las glicoformas de las quimeras fueron analizados por SDS-PAGE e IEF, respectivamente. La actividad biológica in vitro de las variantes de IFN se evaluó midiendo el efecto antiviral en células MDBK infectadas con el virus de la estomatitis vesicular (VSV) y determinando el efecto antiproliferativo sobre el crecimiento de células Daudi. Con el objetivo de estudiar el comportamiento de las quimeras mGMOP/IFN frente al tratamiento térmico, se determinó la actividad biológica residual de las mismas luego de ser sometidas a diferentes temperaturas. Con el propósito de evaluar la influencia de la porción glicosídica sobre los parámetros farmacocinéticos de las muteínas del hIFN-α2b, se realizaron experimentos in vivo utilizando animales de experimentación. Se inocularon ratas Wistar con una única dosis de las diferentes quimeras mGMOP-IFN empleando la vía subcutánea y se extrajeron muestras de sangre a distintos tiempos, determinándose la actividad antiviral de las mismas. A partir de los resultados obtenidos se graficaron los perfiles farmacocinéticos y se calcularon los parámetros Cmáx, Tmáx, t1/2, CLapp y AUC.Resultados: Se construyeron cinco quimeras mediante fusión del péptido mGMOP al extremo N y/o C del hIFN-α2b en diferentes proporciones: mGMOP-IFN, mGMOP2-IFN, mGMOP3-IFN, mGMOP2-IFN-mGMOP y mGMOP3-IFN-mGMOP. Se generaron líneas estables de células CHO‑K1 productoras de las diferentes variantes, las cuales fueron purificadas a partir del sobrenadante de cultivo por cromatografía de inmunoafinidad, obteniéndose recuperaciones entre 40 y 100%. La caracterización fisicoquímica de las nuevas quimeras mediante SDS-PAGE e IEF reveló un incremento de la masa molecular aparente y del contenido de isoformas ácidas conforme al aumento en la proporción péptido/IFN (Figura 1). Figura 1. SDS-PAGE de las variantes de hIFN-α2b (izquierda). Calle 1, IFN no glicosilado (producido en E. coli); calle 2, IFN wild type (producido en células CHO); calle 3, mGMOP-IFN; calle 4, mGMOP2‑IFN; calle 5, mGMOP3-IFN; calle 6, mGMOP2-IFN-mGMOP; calle 7, mGMOP3‑IFN‑mGMOP; calle 8, marcadores de masa molecular; calle 9, GMOP-IFN; calle 10, variante de IFN altamente N‑glicosilada (IFN4N). IEF de variantes de hIFN-α2b (derecha). Calle 1, IFN wild type; calle 2, mGMOP‑IFN; calle 3, mGMOP2-IFN; calle 4, mGMOP3-IFN; calle 5, mGMOP2-IFN-mGMOP; calle 6, mGMOP3-IFN-mGMOP; calle 7, IFN4N.Todas las variantes de IFN retuvieron tanto actividad biológica antiviral como antiproliferativa in vitro con respecto a la molécula no modificada, aunque la capacidad inhibitoria del crecimiento se vio afectada en mayor medida. Por otra parte, las proteínas de fusión exhibieron una estabilidad térmica mayor en forma concomitante con el incremento del grado de O-glicosilación. El análisis farmacocinético en ratas demostró mejoras significativas tanto en el tiempo de vida media plasmática como en el clearance aparente de las variantes hiper O-glicosiladas (mGMOP2-IFN mGMOP y mGMOP3-IFN-mGMOP) con respecto a la variante con menor grado de glicosilación (Tabla 1). La disminución de la actividad biológica in vitro de las nuevas variantes de rhIFN-α2b no resulta desalentador, ya que se ha demostrado que la farmacocinética, que resultó notablemente mejorada como consecuencia de la estrategia de O-glicoingeniería aplicada, constituye una de las propiedades cruciales para la eficacia in vivo de un agente bioterapéutico.Conclusión: Como conclusión general del trabajo, la fusión de múltiples unidades del péptido mGMOP a los extremos amino y/o carboxilo de una proteína constituye una estrategia de glicoingeniería muy atractiva que permite incrementar el grado de O‑glicosilación y, como consecuencia, mejorar las propiedades farmacocinéticas de proteínas terapéuticas con corta vida media en circulación como el hIFN-α2b. El péptido mGMOP constituye una valiosa herramienta para el desarrollo de una plataforma biotecnológica para la producción de proteínas recombinantes terapéuticas con mejores propiedades biológicas.

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