Expresión de la porción soluble del receptor neonatal humano para la fracción inmunoglobulínica Fcg, empleando células de mamífero

TOLOPKA, JI.; OGGERO, M.; ETCHEVERRIGARAY, M.; ATTALLAH, C

Santa Fe

Encuentro; XXI Encuentro de Jóvenes Investigadores de la UNL; 2017

Universidad Nacional del Litoral

INTRODUCCIÓNEl receptor neonatal para el Fc (FcRn) es una proteína heterodimérica constituida por una cadena transmembrana (cadena α) similar a la molécula de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC I), unida en forma no covalente a la microglobulina β2 (β2m). La cadena α está constituida por tres dominios extracelulares (α 1, α 2 y α 3), una región transmembrana y un dominio citoplasmático pequeño (Simister y col., 1989; Burmeister y col.,1994).Aunque el patrón de expresión del FcRn difiere entre especies, generalmente se localiza en células de la barrera hematoencefálica, del epitelio de la vía aérea superior, de riñón, del endotelio vascular y en células presentadoras de antígenos profesionales, así como en otras células de origen hematopoyético (Roopenian y col., 2007). El FcRn se encuentra localizado principalmente en endosomas y tiene la capacidad de unir albúmina sérica (SA) e inmunoglobulina G (IgG) mediante distintos sitios de interacción (Raghavan y col., 1993). Tras ser endocitadas en forma pasiva, la IgG y SA pueden unirse al FcRn en el endosoma tardío, a pH 6,5 o menor. El receptor y su ligando son transportados hacia la membrana plasmática mediante la vía de reciclado de endosomas, donde el incremento de pH, cercano a 7, provoca la liberación del ligando hacia el medio extracelular, rescatándolo así de la degradación lisosomal (Roopenian y col., 2007). Mediante este mecanismo se logra prolongar la vida media de la IgG y la SA en circulación.En los últimos años se ha considerado la posibilidad de modular la actividad del FcRn humano (hFcRn) con la finalidad de aumentar las propiedades farmacocinéticas de anticuerpos terapéuticos, proteínas de fusión a Fc y drogas conjugadas a SA. La determinación de la constante de afinidad del hFcRn por sus ligandos permite predecir la vida media plasmática de tales moléculas, por lo que se han desarrollado estudios pre-clínicos basados en esta interacción (Seijsing y col., 2013).Desde hace unos años, nuestro laboratorio se ha orientado a la obtención de anticuerpos con potencial uso terapéutico, para su empleo en enfermedades relacionadas con un aumento excesivo de la producción endógena de IFN-α. Específicamente, se ha generado una quimera constituida por un fragmento de simple cadena scFv murino anti-IFN-α2b fusionado a la región Fc de la IgG1 humana. Y, por otro lado, se ha humanizado el correspondiente fragmento scFv, fusionándolo posteriormente a la región Fcγ1. Desde este modo, se han generado moléculas con capacidad de neutralizar al IFN-α2b y potencialidad de unir al hFcRn, sobre las cuales se proyecta realizar mutaciones sitio-dirigidas con la finalidad de aumentar su afinidad por este receptor. Debido a la importancia de establecer esta plataforma para nuestro grupo de trabajo, la expresión del hFcRn en forma soluble, obtenido mediante la tecnología del ADN recombinante (rhFcRn), constituye una valiosa herramienta para predecirla vida media plasmática de los anticuerpos terapéuticos en estudio.OBJETIVOSExpresar la región soluble del receptor neonatal humano para la porción Fc (rhFcRn) en su forma heterodimérica y como simple cadena, empleando células de mamífero, a fin de contar con una herramienta para predecir la vida media de anticuerpos terapéuticos.METODOLOGÍAClonado de la región codificante para los dominios extracelulares de la cadena α (αsol), de la β2m y del rhFcRn simple cadenaA partir de un plásmido, enviado a sintetizar oportunamente, que contiene la secuencia del rhFcRn simple cadena (FcRn sc), conformada por la αsol fusionada a la β2m, mediante una secuencia linker (Gly4Ser)3, se obtuvieron las distintas moléculas de interés. Mediante digestión con las enzimas de restricción XbaI/SalI, se obtuvo el fragmento FcRn sc, construcción hasta el momento no reportada, el cual se clonó en el vector de expresión pLV, que confiere resistencia a puromicina. Por otro lado, se obtuvieron los fragmentos correspondientes a las subunidades αsol y β2m, mediante PCR con oligonucleótidos específicos, los cuales incorporan los sitios de restricción que se emplearon para los respectivos clonados. Además, en el caso de la β2m, el oligonucleótido 3? incorpora la secuencia codificante para una etiqueta de 6 Histidinas (His6) que se empleó para la detección del fragmento. La cadena αsol fue digerida con las enzimas XhoI/XbaI y clonada en el vector pCI-neo, que confiere resistencia a neomicina. La β2m fue digerida con las enzimas XhoI/SalI e incorporada al vector pLVmSA CA5E6, el cual posee la secuencia señal de la SA modificada (Attallah y col., 2017) y confiere resistencia a puromicina. En este último caso fue necesario chequear la orientación del fragmento 2m en el vector pLVmSA CA5E6 mediante PCR, empleando un oligonucleótido que hibrida en el vector y otro complementario a la secuencia de interés. Los fragmentos FcRnsc y αsol poseen la secuencia señal propia de la subunidad del hFcRn.Obtención de líneas estables CHO-K1 y HEK293 por transfección con las moléculas de interés, y evaluación de la productividad mediante western blotSe transfectaron células CHO-K1 y HEK293 con las construcciones FcRnsc y, αsol/β2m, mediante cotransfección, empleando Lipofectamine® 2000 (Invitrogen) en la proporción 1:1. En el caso de la contransfección se evaluó también la proporción 2:1 de ADN y agente transfectante. Posteriormente, se inició una presión selectiva con cantidades crecientes de antibiótico, empleándose puromicina en todos los casos, y neomicina en las células cotransfectadas, con el fin de seleccionar aquellas células que hayan incorporado el mayor número de copias del gen de interés. Las líneas fueron presionadas hasta una concentración de antibiótico compatible con la viabilidad de las mismas. Debido a que la albúmina es un ligando natural del FcRn y podría interferir en su detección, se evaluó la producción de 2m, sol y FcRn sc mediante SDS-PAGE (Figura 1.A, Figura 2.A) seguido de western blot (WB) (Figura 1.B, Figura 2.B) en medio libre de suero. Para dichos ensayos se disminuyó gradualmente la concentración de suero fetal bovino en el medio de cultivo hasta lograr esta condición. Por otro lado, fue necesario concentrar los sobrenadantes 8,5 veces, utilizando una membrana de cut-off 10 kDa (PALL), tal como fue descrito por Feng y col. (2011). Para la detección de la 2m se emplearon anticuerpos anti His6 y para la detección de la sol y del FcRn sc anticuerpos anti-hFcRnambos producidos en conejo. Se reveló el ensayo mediante un método quimioluminiscente, empleando anticuerpos anti-inmunoglobulinas de conejo conjugados a HRP (del inglés, horseradishperoxidase).RESULTADOSSe logró detectar la subunidad 2m mediante WB (Figura 1.B) en el sobrenadante concentrado de la línea celular CHO-K1 sol/2m, generada con la proporción 1:1 de ADN y agente transfectante. No se logró detectar la subunidad sol. Por otro lado, no se ha logrado observar la expresión de la 2m en la línea HEK293 sol/2m. Por lo que a fin de evaluar la acumulación de dicha proteína en la vía secretoria, se preparó un extracto celular mediante ciclos de congelación y descongelación, y se evaluó mediante WB. No se evidenció la 2m en el interior de las células (Figura 1.B).Se ha identificado la proteína FcRn sc mediante WB (Figura 2.B) en el sobrenadante concentrado de la línea CHO-K1 FcRn sc. No se ha podido detectar la proteína en el sobrenadante concentrado de la línea HEK293 FcRn sc (resultados no mostrados) ni en el correspondiente extracto celular (Figura 2.B).CONCLUSIONESSe pudo evidenciar la presencia del FcRn sc en células CHO-K1 por WB. Hasta el momento, no se logró obtener el hFcRn como heterodímero debido a la falta de expresión de la sol. Existe evidencia de que la sobreexpresión de la 2m dificulta la asociación de ambas subunidades para obtener un FcRn funcional y, por otro lado, está reportada la dificultad en la estequiometria de la expresión de dos moléculas de diferente tamaño. Actualmente, se está trabajando en mejorar la productividad del receptor, por lo que se generaron líneas estables mediante transducción de células HEK293 tanto en adherencia como en suspensión, con las construcciones del FcRn sc, y sol/2m. El empleo de células humanas se fundamenta en el objetivo último del grupo de trabajo, que consiste en la determinación de la constante de afinidad del rhFcRn por los anticuerpos en estudio (lo expuesto hasta aquí sirve como evaluación de las construcciones generadas). Resulta importante mencionar que la obtención de células que expresen el rhFcRn en forma soluble mediante una transducción, aún no ha sido descrita en la bibliografía.BIBLIOGRAFÍA BÁSICAAttallah, C., Etcheverrigaray, M.,Kratje, R.,Oggero, M., 2017.A Highly Efficient Modified Human Serum Albumin Signal Peptide to Secrete Proteins in Cells Derived from Different Mammalian Species. Protein Expression and Purification, 132: 27?33.Borrok, M. J., Wu, Y., Beyaz, N., Yu, X. 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