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INTRODUCCIÓN La hormona folículo estimulante humana (hFSH) juega un rol importante en la regulación y mantenimiento de los procesos reproductivos. Con este fin, la hormona para uso clínico es producida en forma recombinante a partir de células CHO. En nuestro laboratorio, se generaron hibridomas productores de anticuerpos monoclonales (mAbs) anti-rhFSH con el fin de emplearlos como ligandos para purificar la hormona mediante cromatografía de inmunoafinidad. Sin embargo, la preparación de mAbs en cantidad necesaria para purificar la hormona con fines terapéuticos, resulta dificultosa, costosa, demanda mucho tiempo puesto que implica el empleo de animales de laboratorio o, bien, el cultivo de hibridomas en presencia de suplementos de origen bovino. Una alternativa para salvar estos obstáculos es la obtención de un fragmento variable de anticuerpo de cadena única (scFv) (del inglés, single-chain variable fragment), formado por la unión covalente de las regiones variables de la cadena pesada (VH) y liviana (VL), del correspondiente mAb, mediante un péptido linker y, así, expresado como una única cadena proteica. Generalmente, éste se caracteriza por presentar una afinidad similar al anticuerpo original, y tiene la propiedad de conferir al proceso ventajas tecnológicas y operativas, tales como: facilidad en su producción (ya que puede ser expresado en bacterias), menor costo y tiempo del proceso y eliminación del uso de animales de experimentación. Asimismo, es posible obtener rendimientos, del mismo orden o superiores a los alcanzados mediante la producción habitual de mAbs a través del cultivo in vitro de células especializadas como los hibridomas. Por lo tanto, el objetivo general del proyecto consiste en la obtención de un scFv, a partir de un hibridoma murino productor de un mAb anti-rhFSH, lo que permitiría optimizar el proceso de purificación de la hormona recombinante. METODOLOGÍA Construcción del fragmento scFv anti-rhFSH: para la construcción del conjunto de secuencias correspondientes a VH y VL, derivadas del mAb murino P1E4 (anticuerpo anti-rhFSH original obtenido previamente en nuestro laboratorio), se realizó la extracción de ARN total a partir del cultivo del correspondiente hibridoma. Luego, por transcripción reversa, utilizando primers antisense específicos se generó el ADN copia correspondiente a los transcriptos VH y VL, que fueron utilizados como molde en una serie de amplificaciones por PCR. Los primers sense y antisense utilizados constituyen una biblioteca diseñada para amplificar las regiones variables de ambas cadenas del anticuerpo. Los fragmentos amplificados fueron purificados y clonados en el vector pCR®2.1 TOPO® (Invitrogen), y utilizados para transformar células competentes E. coli Top10. Las transformaciones fueron chequeadas mediante colony-PCR y posterior electroforesis en gel de agarosa para seleccionar, en función del tamaño deseado, los clones candidatos para ser secuenciados. A partir de las secuencias de ADN, se realizó un análisis bioinformático que incluyó la agrupación de las secuencias según su homología, con el programa Vector NTI Advance® ContigExpress®, una búsqueda de secuencias de proteínas con homología a las secuencias traducidas (BLASTX) y, finalmente, el análisis de las secuencias aminoacídicas correspondientes para la identificación de las 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cada región variable. Una vez definidas las secuencias VH y VL, se diseñaron 6 primers específicos para la construcción del scFv, mediante la técnica de SOE-PCR (del inglés, Splicing by Overlap Extension Polymerase Chain Reaction) que permite el empalme de fragmentos de ADN en un polinucleótido de mayor tamaño, debido al solapamiento de regiones homólogas presentes en cada uno. El clonado se realizó en el vector pET22b (Novagen) en los sitios NcoI/HindIII. Este vector incorpora en la proteína de interés, el péptido señal pelB, que la direcciona al espacio periplásmico de las células y una etiqueta constituida por 6 residuos de histidina, en el extremo C-terminal de la misma. La secuencia del linker se obtuvo a partir de un scFv anti-rhIFN-α2b generado con anterioridad en nuestro laboratorio. Expresión del fragmento scFv: la expresión se llevó a cabo en espacio periplásmico de E. coli, transformando células competentes BL21(DE3) y BL21(DE3) Rosetta con la construcción pET22b-scFvP1E4. La expresión se llevó a cabo a partir de un cultivo saturado al que se adicionó ampicilina en concentración 50 ng/ml y glicerol al 0,2% (V/V). Este cultivo se incubó en agitación a 200 rpm, durante 4 h en estufa a 30°C. Luego, se adicionó el reactivo IPTG en concentración 1mM para inducir la expresión del scFv, procediéndose a cultivar en agitación y a temperatura ambiente (22°C) durante 16 h. Finalmente, se realizó la extracción del scFv a partir del espacio periplásmico mediante shock osmótico. La expresión y la capacidad de unir al antígeno (rhFSH) fueron analizadas mediante western blot (WB) y ELISA específico indirecto, respectivamente. RESULTADOS A partir de las reacciones de amplificación se obtuvieron fragmentos de ADN cuyos tamaños moleculares oscilaron entre 250 pb y 500 pb, constituyendo un conjunto formado por más de 150 clones de los cuales se seleccionaron 64 correspondientes a VH y 29 a VL para ser secuenciados. Mediante análisis bioinformático de las secuencias obtenidas, se logró, por un lado, descartar varios clones cuyas secuencias resultaron homólogas a proteínas diferentes a scFv, y por el otro, agrupar aquellas con elevado grado de homología a secuencias de inmunoglobulinas murinas en 5 grupos para VH y 5 grupos para VL. Mediante la traducción y el alineamiento de las secuencias de cada grupo se definieron las secuencias consenso denominadas VH016 y VL088, en las cuales se identificaron de manera precisa los 3 CDRs. A partir de ambas regiones variables y el linker, se construyó el fragmento scFv P1E4 anti-rhFSH, el cual se clonó en los sitios NcoI/HindIII del vector pET22b. Luego de la transformación de células E.coli Top10, e identificación de clones positivos por colony PCR, se procedió a transformar las cepas de expresión BL21 y BL21 Rosetta con la misma construcción. Las fracciones de purificación a partir de espacio periplásmico, evaluadas mediante WB, mostraron, por un lado, una buena eficiencia de expresión para ambas cepas, y por el otro, un mayor nivel de expresión para el caso de la cepa Rosetta inducida con IPTG. Sin embargo, los resultados del ELISA específico indirecto, indicaron una mayor capacidad de interación hacia rhFSH por parte de los fragmentos expresados en la cepa BL21 sin inducción. CONCLUSIONES Se logró aislar las secuencias codificantes de las regiones VH y VL del mAb P1E4 anti rhFSH, y construir su correspondiente scFv. Dicho fragmento fue clonado y expresado en el espacio periplásmico de las cepas de expresión BL21 y BL21 Rosetta exhibiendo capacidad para reconocer a la hormona rhFSH. Como perspectiva de trabajo, este fragmento scFv será expresado en citoplasma de las células E. coli SHuffle T7 pLys. Luego, se determinará la constante de afinidad del fragmento recombinante, y se comparará con la del mAb original. Finalmente el scFv será purificado mediante cromatografía de afinidad a iones metálicos inmovilizados, para su posterior evaluación como ligando en una cromatografía de inmunoafinidad para la purificación de dicha hormona.

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