Desarrollo de un ELISA de competición para la cuantificación de eritropoyetina

OGGERO EBERHARDT, M.; KRATJE, R. B.; ETCHEVERRIGARAY, M.

Santa Fe. Pcia. Santa Fe. Argentina

Jornada; Cuartas Jornadas de Comunicaciones Técnico-Científicas. Encuentro Bioquímico del Litoral; 1996

Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas (UNL); Colegio de Bioquímicos de Entre Ríos; Colegio de Bioquímicos de Santa Fe ? 1ª C.; Sociedad de Bioquímicos de Santa Fe

El proceso de producción de eritropoyetina humana por cultivo de células animales recombinantes planteó la necesidad de contar con un ensayo de alta sensibilidad que permita su cuantificación. La aplicación de la técnica puesta a punto debía adecuarse para el dosaje de la hormona tanto en los sobrenadantes de cultivos celulares como en los sucesivos pasos de la purificación . De esta manera se podría evaluar la productividad de las células en el cultivo y determinar los parámetros del downstream processing. El sistema seleccionado consiste en un enzimoinmunoensayo (ELISA) de competición. Existen dos metodologías para cuantificar antígenos por ensayos de competición: un ensayo de captura de antígeno y un ensayo de captura de anticuerpo. Este último, que se muestra en el presente trabajo, se basa en la inmovilización del antígeno en fase sólida y su posterior competición in situ con el antígeno soluble por un anticuerpo en solución. Con ese fin se obtuvieron sueros inmunes de conejo utilizando dos planes diferentes de inmunización. Los títulos de ambos sueros dosados por ELISA específico indirecto fueron de 1/400.000. Se sensibilizaron placas de polivinilo con 16,5 ng de eritropoyetina estándar en buffer carbonato/bicarbonato 50 mM (pH 9,6). La reacción de competición se desarrolló agregando alternativamente el antígeno soluble estándar desde 1.000 a 1,95 ng/ml o la muestra a dosar en 10 diluciones al medio sucesivas, y el suero de conejo. Los anticuerpos retenidos por el antígeno en fase sólida se revelaron con anticuerpos de cabra anti-inmunoglobulinas de conejo conjugados con peroxidasa. El sustrato enzimático empleado fue agua oxigenada en presencia de o-fenilendiamina. La sensibilidad del ensayo, expresada como la mínima cantidad de eritropoyetina capaz de ser detectada, fue de 1,5 ng. Los ensayos de competición permiten además, comparar la avidez de un anticuerpo en su unión con el antígeno. La avidez de la interacción antígeno-anticuerpo está determinada por tres factores: i) la afinidad intrínseca del anticuerpo por un epitope, ii) la valencia del anticuerpo y el antígeno, y iii) el ordenamiento geométrico-estructural de los componentes interactuantes. Debido a que la avidez describe en forma completa este tipo de interacción, es el parámetro determinante del éxito de una reacción inmunoquímica. Los ensayos realizados en paralelo con los dos sueros policlonales de conejo obtenidos demostraron el diferente comportamiento de ambos reactivos. Se seleccionó uno de ellos como el mejor reactivo de trabajo sobre la base de su avidez, estimada a partir del valor de la pendiente de la curva de competición.