Controles de calidad de eritropoyetina humana recombinante como materia prima para la elaboración de medicamentos

ETCHEVERRIGARAY, M.; BOLLATI FOGOLÍN M. R.; OGGERO EBERHARDT, M.; KRATJE, R. B.

Santa Fe. Pcia. Santa Fe

Jornada; Cuartas Jornadas de Comunicaciones Técnico-Científicas. Encuentro Bioquímico del Litoral; 1996

Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas (UNL); Colegio de Bioquímicos de Entre Ríos; Colegio de Bioquímicos de Santa Fe ? 1ª C.; Sociedad de Bioquímicos de Santa Fe

La administración periódica de eritropoyetina (EPO) humana exógena es un tratamiento eficaz para revertir la anemia asociada a la enfermedad renal crónica. El objetivo del trabajo aquí presentado consistió en la puesta a punto de los controles de calidad de EPO para ser empleada como materia prima en la elaboración de medicamentos. Para la aprobación por la autoridad sanitaria competente la hormona debe cumplir con los ensayos de: i) IDENTIFICACIÓN: mediante la determinación de la composición de aminoácidos; ensayos de electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) en condiciones nativa y aglicosilada; inmunocaracterización por Western-blot. ii) VALORACIÓN: incluye los ensayos de valoración biológica in vitro (Ensayo Krystal) e in vivo (en ratón exhipóxico); ensayos de valoración inmunoquímica por ELISA. iii) PUREZA: incluye los ensayos de electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) con tinción de plata; cromatografía líquida de alta performance (HPLC); determinación de la actividad específica; determinación de ausencia de contaminantes específicos (antígenos de las células productoras, ADN de células productoras, inmunoglobulinas de ratón y micoplasmas) y de piretógenos; verificación de inocuidad y esterilidad. En nuestro laboratorio, hasta el momento, se pusieron a punto controles de calidad de cada una de las tres categorías enumeradas, a saber: i) SDS-PAGE en condiciones nativa y aglicosilada, demostrándose el peso molecular correcto de las especies en estudio. Inmunocaracterización: la calidad de la EPO producida se siguió por ensayos de Western-blot con anticuerpos monoclonales anti-EPO, demostrándose que la molécula no sufre cambios durante el proceso de cultivo en el biorreactor ni durante la posterior etapa de purificación. También se observó por este ensayo que la molécula no difiere para los distintos clones productores. ii) Valoración inmunoquímica mediante un ELISA de competición cuya sensibilidad resultó de 1,5 ng. iii) Los ensayos de pureza mediante la técnica SDS-PAGE con tinción de plata mostraron la presencia de una banda ancha con movilidad correspondiente a EPO. Asimismo se cumple el requisito de que las proteínas contaminantes no superen el 1%. En cuanto a la determinación de ausencia de contaminantes específicos, se realizó el dosaje de antígenos de las células precursoras por INMUNO-DOT con un antisuero obtenido en conejos inmunizados con lisado de células BHK. El título de anticuerpos anti-BHK del antisuero fue 1/50.000 y la sensibilidad del ensayo fue 23,4 ng de proteínas celulares, que corresponde al contenido proteico de aproximadamente 250 células. Este límite de detección es significativamente inferior al contenido máximo de proteínas celulares contaminantes aceptadas en la preparación de EPO.