Desarrollo de estrategias para la purificación de ureasa utilizando técnicas de cromatografía de afinidad con ligandos pseudobiomiméticos

OGGERO EBERHARDT, M.; GARCILAZO, S.; BOLLATI FOGOLÍN M. R.; ALEANZI, M.

Santa Fe. Pcia. de Santa Fe

Jornada; Terceras Jornadas de Comunicaciones Técnico-Científicas de la Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas - UNL; 1994

Secretaría de Ciencia y Técnica (FBCB-UNL)

La producción de ureasa a partir de poroto de soja a pesar de ofrecer menor contenido relativo a esta enzima en relación con la fuente clásica (jack bean), permitiría reducir el costo de su producción por tratarse de un cultivo industrial de gran rendimiento regional. La cromatografía de afinidad metal inmovilizado (IMAC) se fundamenta en la interacción de iones metálicos inmovilizados (Cu(II), Ni(II), Zn(II) y Co(II)) sobre una matriz polimérica y grupos funcionales de la superficie de la macromolécula. Estos grupos funcionales para el caso de las proteínas son histidina, cisteína y triptófano. La ureasa producida a partir de poroto de soja y la obtenida a partir de jack vean tienen un contenido porcentual de histidina y cisteínas muy similar, lo cual despertó interés en la posibilidad de utilizar IMAC como alternativa de un proceso directo para la purificación de ureasa de soja, de elevado rendimiento y bajo costo de purificación. El trabajo se estructuró en dos etapas: 1) Análisis de distintos métodos de extracción y purificación parcial por procedimientos tradicionales (extracción acuosa, extracción Summer, precipitación salina, y con solventes orgánicos). Estudio de la estabilidad de la enzima en solución etanólica al 32% y en fase sólida sobre matrices activadas con metales. Debido a que los métodos de extracción y purificación tradicionales ensayados originan pérdida importante de enzima respecto AL extracto acuoso, se seleccionó éste como punto de partida para el desarrollo de la técnica cromatográfica, a pesar de que los métodos de precipitación con solventes orgánicos permiten enriquecer el contenido enzimático de la extracción acuosa. Las pruebas de estabilidad de la enzima muestran que solubilizada en etanol es estable en el tiempo y a bajas temperaturas. Los ensayos en fase sólida indican que los soportes sensibilizados con Ni(II) resultan más ventajosos para conservar activa la enzima inmovilizada respecto a aquellas sensibilizadas con Zn(II) o Cu(II) donde la actividad ureasa decrece en el tiempo o es nula respectivamente. 2) Purificación del extracto seleccionado en la fase anterior, por el método IMAC. Se observó una retención diferencial de ureasa según la matriz estuviese activada con Cu(II), Ni(II), o Zn(II), concluyéndose que la interacción es más fuerte y menos selectiva en siguiente orden: Cu(II) > Ni(II) > Zn(II). Se comprobó que las condiciones óptimas de equilibración para la retención selectiva fueron: buffer de equilibración de elevada fuerza iónica, muestra sin dializar contra el buffer anterior, y buffer de elución del volumen de exclusión con baja fuerza iónica. En las columnas sensibilizadas con Ni(II) y Zn(II) se retiene ureasa, aunque no se encontró aún ninguna condición de elución selectiva que permita la recuperación de la enzima y el incremento de actividad enzimática específica.