Purificación de anticuerpos monoclonales de ascitis de ratón utilizando técnicas de cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC)

BOLLATI FOGOLÍN M. R.; OGGERO EBERHARDT, M.; ALEANZI, M.

Santa Fe. Pcia. de Santa Fe

Jornada; XIV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología y Enfermedades Parasitarias (SAPYEP); 1995

Sociedad Argentina de Protozoología y Enfermedades Parasitarias

Los anticuerpos monoclonales constituyen una poderosa herramienta en su aplicación a numerosos campos de la biología y medicina. La técnica más comúnmente empleada para la purificación de IgG de especies murinas es la cromatografía de afinidad sobre proteínas A inmovilizada. Las condiciones de elución a pH bajos utilizadas en este tipo de cromatografías pueden producir la precipitación de los anticuerpos monoclonales debido a la limitada estabilidad y solubilidad que presentan. El objetivo de este trabajo es proporcionar una técnica de purificación alternativa de anticuerpos monoclonales que solucione los inconvenientes que puedan presentarse durante la purificación sobre proteína A. Para tal fin seleccionamos la cromatografíoa de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC), eligiendo condiciones de elución no desnaturalizantes (pH cercano a neutralidad). IMAC es una eficaz metodología analítica y preparativa que combina la interacción selectiva de los metales inmovilizados con una alta capacidad, estabilidad y versatilidad de la matriz quelante. Anticuerpos monoclonales de tipo IgG3 de ascitis de ratón (*) dirigidos contra una glicoproteína de membrana de Trypanosoma cruzi, fueron purificados sobre una matriz de IDA-Sepharosa 6 B quelada alternativamente con Ni(II) o Zn(II). Ambos metales fueron capaces de ligar el anticuerpo. Las matrices sensibilizadas con Zn(II) fueron más selectivas mientras que las sensibilizadas con Ni(II) presentaron superior capacidad operativa. La purificación fue llevada a cabo empleando como eluyentes imidazol seguido de EDTA. El anticuerpo fue fuertemente retenido bajo las condiciones de iniciación ensayadas y la fracción purificada fue eluida con EDTA a pH neutro. La recuperación medida como actividad de anticuerpo fue del 90% en esta última fracción sobre matrices acopladas a Ni(II). La pureza de dicha fracción, analizada por PAGE-SDS, ofreció valores en torno al 80%. La pureza fue incrementada con una prepurificación del fluido ascítico con sulfato de amonio. Estos resultados fueron obtenidos aplicando sobre estas columnas hasta 30mg. de proteínas por ml por matriz, mostrando de esta manera la posibilidad de aplicar matrices sensibilizadas con Ni(II) a procesos de purificación a gran escala. Las muestras prefraccionadas con sulfato de amonio fueron purificadoas casi a homogeneidad sobre Zn(II) inmovilizado, con una similar recuperación del anticuerpo a la obtenida sobre columnas de Ni(II), pero la capacidad operativa (capacidad por volumen de resina y por ciclo en condiciones determinadas) demostrada fue menor. (*) La ascitis correspondiente al hibridoma 2E9 fue gentilmente cedida por el Instituto Dr. Mario Fatala Chabén.