Obtención de un panel de anticuerpos monoclonales para el estudio inmunoquímico del Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos (GM CSF)

OGGERO EBERHARDT, M.; KRATJE, R. B.; ETCHEVERRIGARAY, M.

Santa Fe. Pcia. Santa Fe. Argentina

Jornada; Cuartas Jornadas de Comunicaciones Técnico-Científicas. Encuentro Bioquímico del Litoral; 1996

Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas (UNL); Colegio de Bioquímicos de Entre Ríos; Colegio de Bioquímicos de Santa Fe ? 1ª C.; Sociedad de Bioquímicos de Santa Fe

El Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos (GM-CSF) humano es una glicoproteína que activa la proliferación, diferenciación y compromiso de las células precursoras hematopoyéticas. Con el objeto de realizar el estudio inmunoquímico de GM-CSF recombinante humano producido en diferentes sistemas huésped, se planteó la necesidad de obtener un panel de anticuerpos monoclonales. Fue necesario, previamente, contar con ensayos adecuados para la determinación de la concentración de anticuerpos anti GM-CSF en plasma de ratón y en sobrenadantes de cultivo de hibridomas. Con este fin se pusieron a punto dos ensayos de ELISA indirectos, que difieren únicamente en el paso de incubación de las placas de polivinilo con la muestra. La sensibilización de las placas se realizó con 0,5 μg de GM-CSF estándar y el bloqueo, con una solución de seroalbúmina bovina al 1%. Para el dosaje de anticuerpos en plasma de ratón , el bloqueo se realizó previo al agregado de la muestra de plasma en diluciones sucesivas, pudiéndose obtener el título de anticuerpos de cada animal. En cambio, en el caso de los sobrenadantes de cultivo, el bloqueo se realizó simultáneamente durante la incubación con pequeños volúmenes de muestra de cada uno de los sobrenadantes de cultivo a analizar. El revelado se realizó con anticuerpos de conejo anti-inmunoglobulinas de ratón conjugados con peroxidasa. El sustrato enzimático empleado fue agua oxigenada en presencia de o-fenilendiamina. Para el desarrollo de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales anti GM-CSF, se inmunizaron ratones BALB/c hembras de dos meses de edad por vía intraperitoneal inoculando 50 μg de GM-CSF cada 7 días durante 3 semanas. El título de anticuerpos específicos en plasma de ratón, dosados por ELISA indirecto fue 1/100.000. Luego de un período de descanso de 15 días a 2 meses se realizó la fusión de las células de bazo del ratón inmunizado con células de mieloma no secretor de ratón (NSO), en relación 108:107, respectivamente. Los resultados de las fusiones se expresan como eficiencia de crecimiento de híbridos de fusión respecto al número total de pozos sembrados (Eficiencia A) y como eficiencia de crecimiento de híbridos productores de anticuerpos anti GM-CSF respecto a los híbridos totales (Eficiencia B). Hasta el momento se realizaron dos fusiones. En la primer fusión se obtuvieron los siguientes resultados: Eficiencia A = 5,4% y Eficiencia B = 1,9%. En la segunda fusión los resultados fueron 3,0% y 16,7%, respectivamente. Los híbridos productores fueron clonados por el método de dilución límite y conservados en nitrógeno líquido para su caracterización posterior.