APARSPS: una nueva etiqueta para la inmunodetección de proteínas recombinantes

PEROTTI, N.; ETCHEVERRIGARAY, M.; KRATJE, R. B.; OGGERO EBERHARDT, M.

Buenos Aires. Argentina

Congreso; XI Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial (SAFYBI); 2007

Asociación Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial

INTRODUCCIÓN: La estrategia de etiquetado de proteínas mediante péptidos se ha convertido en una herramienta eficaz para detectar, localizar y purificar proteínas recombinantes, eliminando la necesidad de generar anticuerpos específicos para cada proteína objeto de análisis. Los recientes avances en genómica y proteómica funcional justifican la búsqueda de nuevas etiquetas puesto que ningún epitope es ideal para diferentes aplicaciones. Por otro lado, el hallazgo de pequeños epitopes es un aspecto que adquiere máxima relevancia en el diseño de proteínas de fusión cuya funcionalidad no debe ser afectada por la adición de los mismos. Estudios previos [Oggero et al., (2004) Mol Div. 8: 257-269] identificaron el epitope secuencial APAR, derivado del Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos humano (hGM CSF). Dicho péptido fue seleccionado como etiqueta para la preparación de proteínas de fusión ya que es suficientemente pequeño y es reconocido por un anticuerpo monoclonal (mAb) que presenta capacidad para interaccionar, simultáneamente, con la molécula del hGM-CSF nativa y desnaturalizada. MATERIALES Y MÉTODOS: El mencionado epitope peptídico, identificado mediante técnica de SPOT síntesis, fue fusionado a la molécula de interferón-alfa2b humano (hIFN-alfa2b) con el fin de estudiar su potencialidad como etiqueta para inmunodetección de proteínas recombinantes. Mediante técnica de PCR, el péptido fue incorporado al extremo N terminal de la molécula de IFN empleando un brazo espaciador constituido por la secuencia de aminoácidos SPS, naturalmente presentes en la estructura del hGM CSF. La proteína de fusión APARSPS-IFN-alfa2b, expresada en E.coli BL-21 y células CHO, fue analizada mediante ensayos de Western Blot, Dot Blot, ELISA sandwich y ensayos de evaluación de actividad biológica anti-viral del IFN utilizando células MDBK y virus VSV RESULTADOS Y CONCLUSIONES: El péptido APARSPS, fusionado al IFN y expresado en células eucariotas y procariotas, fue reconocido mediante ensayos de Western Blot empleando el mAb anti hGM CSF. Por otro lado, la proteína de fusión fue evaluada mediante ensayos de Dot Blot y ELISA sandwich, demostrando un límite de detección de 1,56 μg.ml-1 y 62,5 ng.ml-1, respectivamente. Estas características confirmaron la utilidad del péptido APARSPS como etiqueta para el diseño de proteínas de fusión reconocidas mediante procedimientos que conservan la conformación nativa de la proteína o, contrariamente, implican su desnaturalización. Finalmente, la presencia del péptido fusionado a la molécula de hIFN alfa2b no alteró la actividad biológica específica de la citoquina comparada con la correspondiente molécula salvaje. En conclusión, se ha identificado una nueva y pequeña etiqueta peptídica que, siendo adecuada para el estudio de proteínas, no interferiría con la función de la misma.