Producción de anticuerpos recombinantes anti hIFN-alfa con fines terapéuticos

DEPETRIS, M.; OGGERO EBERHARDT, M.; ETCHEVERRIGARAY, M.; KRATJE, R. B.

Buenos Aires. Argentina

Congreso; XI Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial (SAFYBI); 2007

Asociación Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial

INTRODUCCIÓN: Diversas enfermedades de naturaleza autoinmune y desórdenes inflamatorios, como el lupus eritematoso sistémico y la diabetes mellitus tipo I, se caracterizan por la sobreexpresión de Interferón alfa humano (hIFN alfa). Esta citoquina está involucrada tanto en el inicio como en el mantenimiento de la sintomatología, convirtiéndola en un blanco atractivo para el desarrollo de estrategias terapéutic basadas en el empleo de anticuerpos monoclonales neutralizantes de su actividad biológica. En el presente trabajo se propone la preparación de fragmentos variables de cadena única (scFv) anti hIFN alfa2b para su utilización clínica en los casos en que esta citoquina origina efectos adversos altamente desfavorables que comprometen la salud humana. MATERIALES Y MÉTODOS: La obtención de los fragmentos scFv a partir de mAbs anti hIFN alfa2b se llevó a cabo mediante el sistema RPAS (Recombinant Phage Antibody System, GE Healtcare, Suecia). Los genes de las regiones variables de la cadena pesada (VH) y liviana (VL) conectados por un ADN linker se clonaron en el vector pCANTAB 5 E. Se transformaron células de E. coli TG-1 para la obtención de fagos recombinantes que luego fueron enriquecidos selectivamente mediante técnica de panning contra el antígeno inmovilizado en fase sólida. Con los fagos seleccionados se infectaron células de E. coli HB2151 para obtener clones productores de fragmentos scFv solubles. A partir de extractos del espacio periplásmico de las bacterias se purificaron los fragmentos mediante cromatografía de afinidad utilizando el anticuerpo E tag acoplado a una matriz de Sepharose (RPAS purification module, GE Healthcare). Posteriormente, se determinó la constante de afinidad mediante técnica de ELISA y la capacidad neutralizante de la actividad biológica in vitro del IFN-alfa utilizando células MDBK y virus VSV. Adicionalmente, con el objeto de mejorar su capacidad de unión al hIFN alfa, se llevó a cabo una técnica de mutagénesis al azar sobre la secuencia nucleotídica de un fragmento seleccionado, induciendo un aumento en la tasa de mutación de la enzima Taq Polimerasa por el agregado de cationes Mn2+ en la técnica de PCR. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Se logró la obtención de fragmentos scFv (CA5E6 y CB27H2) a partir de mAbs anti hIFN alfa2b. En el caso del scFv CA5E6 no se observó una disminución significativa de la afinidad a la molécula de IFN con respecto al mAb completo (1,5.108 M-1 y 2,2.108 M-1, respectivamente). Por otro lado, el fragmento scFv CB27H2 presentó una disminución drástica en su constante de afinidad comparándolo con su correspondiente mAb (0.37.108 M-1 y 11.108 M-1, respectivamente). El fragmento CA5E6 neutralizó, en ensayos in vitro, la actividad biológica de un amplio espectro de moléculas de IFN alfa, entre ellas, las citoquinas humanas recombinantes IFN alfa2a e IFN alfa2b y una colección heterogénea producida tras la activación de leucocitos y células Namalwa. Desarrollando una estrategia de mutagénesis al azar fue posible introducir sustituciones en la secuencia del scFv CA5E6 generándose un nuevo panel de fragmentos recombinantes. Utilizando la técnica de phage display fue posible aislar un fragmento (EP18) que presentó un constante de afinidad mejorada (3,5.108 M-1), incluso superior a la correspondiente al mAb de partida. De esta manera, el fragmento scFv EP18 resulta adecuado para ser utilizado en estudios posteriores destinados a evaluar su capacidad terapéutica frente a un incremento agudo o crónico del IFN alfa en determinadas patologías humanas.