Characterization of recombinant glycoproteins: effect of culture conditions on glycosilation pattern.

FORNO, A. G.; BOLLATI FOGOLÍN M. R.; OGGERO EBERHARDT, M.; KLEIN, G.; KRATJE, R. B.; ETCHEVERRIGARAY, M.; CONRADT, H.; PUCCI, P.

La Habana

Workshop; Tercer Seminario Latino-Americano de Tecnología de Cultivos Celulares (III-SLATCC); 2008

Centro de Inmunología Molecular (CIM)

En el marco del 3º Seminario Latino-Americano de Tecnología de Cultivos Celulares (III-SLATCC) llevado a cabo en Habana (Cuba), entre el 23 y 27 de junio de 2008, la Dra. Guillermina Forno expuso sobre el tema ?Characterization of recombinant glycoproteins: effect of culture conditions on glycosilation pattern?, mostrando resultados del grupo de trabajo de Cultivos Celulares de la Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral, cuyos investigadores se incluyen como co-autores a los fines de esta presentación (ver archivo adjunto). Se resume a continuación el contenido de la exposición oral. La mayoría de las proteínas secretadas por las células de mamíferos son glicoproteínas. Estas glicoproteínas poseen oligosacáridos unidos covalentemente a un residuo asparagina (tipo N) o a un residuo de serina o treonina (tipo O). Las estructuras de oligosacáridos de las glicoproteínas pueden tener un profundo efecto sobre propiedades críticas tales como clearance, antigenicidad, inmunogenicidad, actividad específica, solubilidad, resistencia a inactivación térmica y resistencia al ataque con proteasas. El Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos humano recombinante (rhGM-CSF) es un polipéptido glicosilado de 127 aminoácidos que estimula la proliferación y maduración de células progenitoras mieloides. Cuando se produce a partir de células de mamíferos aproximadamente el 50% de su masa molecular corresponde a oligosacáridos. Se realizó la producción de rhGM-CSF a partir de células CHO, su purificación, el análisis de su actividad biológica in vitro y la descripción completa del patrón de glicosilación de la molécula producida en diferentes condiciones de cultivo. Además se evaluó su perfil farmacocinético comparándolo con la molécula producida en E. coli. La purificación por cromatografía de inmunoafinidad permitió obtener preparaciones de rhGM-CSF con elevado grado de pureza y recuperación. A partir de estas preparaciones se caracterizaron los carbohidratos unidos a los sitios de N- y O glicosilación, así como el grado de ocupación de los sitios de N-glicosilación. Para ello se emplearon técnicas de espectrometría de masas (ionización por electroespray, MALDI/TOF-MS y técnicas de MS/MS) y cromatografía de intercambio aniónico a pH elevado con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). El análisis por MALDI/TOF-MS y HPAC-PAD indicó la presencia predominante de cadenas de oligosacáridos tri- y tetraantenarios con y sin unidades repetidas N-acetil-lactosamina. Más del 90% de los residuos terminales galactosa se encontraron alfa2-3 sialilados, con ácido neuramínico (93%) o ácido glicolilneuramínico (7%). En el análisis de la glicosilación específica de sitio se demostró que en las formas de GM-CSF monoglicosiladas, más del 90% del sitio de glicosilación en Asn37 se encontró ocupado por oligosacáridos y que para esta población de moléculas la Asn-27 exhibió un grado muy bajo de ocupación. Cuando se estudió la influencia de la porción glicosídica de la molécula de rhGM-CSF sobre la eliminación plasmática de la citoquina empleando un modelo murino, se puso en evidencia que la glicosilación prolonga la distribución y el tiempo de eliminación plasmática de la citoquina.