Nuevas estrategias para la obtención de moléculas hiperglicosiladas de interferón alfa

GUGLIOTTA, A.; CEAGLIO, N.; OGGERO EBERHARDT, M.; ETCHEVERRIGARAY, M.; KRATJE, R. B.

Santa Fe. Pcia. Santa Fe. Argentina

Jornada; XIII Encuentro de Jóvenes Investigadores de la Universidad Nacional del Litoral ? IV Encuentro de Jóvenes Investigadores de Universidades de Santa Fe; 2009

Universidad Nacional del Litoral; Universidad Católica de Santa Fe; Universidad Tecnológica Nacional ? Facultad Regional Santa Fe

Los interferones (IFNs) constituyen una familia de proteínas específicas de especie sintetizadas por células eucariotas en respuesta a virus y otros estímulos antigénicos. El IFN-alfa está constituido por una familia de 14 proteínas diferentes pero estructuralmente relacionadas que poseen 166 aminoácidos, con excepción del IFN alfa2 que carece del residuo ácido aspártico en la posición 44 y por lo tanto exhibe 165 aminoácidos. La mayoría de las especies de IFN-alfa no contiene sitios consenso de N glicosilación. El único subtipo en donde se ha demostrado la existencia de O-glicosilación es el IFN alfa2, que contiene el disacárido galactosil N acetilgalactosamina unido a la Thr106. Los IFNs de tipo I presentan un amplio espectro de actividades biológicas (antiviral, antiproliferativa e inmunomoduladora) que ha potenciado el área de investigación y desarrollo de medicamentos basados en las formas recombinantes de dichas moléculas. En particular, la formulación no glicosilada del IFN alfa2 producido en bacterias (E. coli) se emplea terapéuticamente en el tratamiento de hepatitis crónica B y C y otras patologías tumorales como sarcoma de Kaposi y linfoma folicular no-Hodgkin, entre otras. No obstante, debido a su rápida inactivación y eliminación del organismo, el empleo de IFN como fármaco sistémico requiere la administración de dosis elevadas y frecuentes con el fin de alcanzar la ventana terapéutica. Esta particularidad se traduce en la aparición de efectos secundarios que incluyen síntomas gripales tales como fiebre, fatiga, escalofríos, mialgias y artralgias y algunos efectos psicológicos como depresión e irritabilidad. Por este motivo, la aplicación de estrategias que permitan mejorar las propiedades farmacocinéticas de esta proteína constituye un aspecto de gran relevancia con el fin de aumentar su actividad biológica in vivo y, en consecuencia, su eficacia terapéutica. Considerando que los oligosacáridos afectan numerosas propiedades de las glicoproteínas, nuestro laboratorio ha aplicado con éxito técnicas de glicoingeniería, en particular, la introducción de sitios potenciales de N-glicosilación, para la obtención de muteínas de rhIFN alfa2b con propiedades mejoradas respecto a la proteína nativa. En particular, en nuestro laboratorio se obtuvo una variante con cuatro sitios de N-glicosilación (denominada IFN-4N) que, a pesar de demostrar una menor actividad biológica in vitro, exhibió una vida media 25 veces superior y un clearance sistémico 20 veces inferior con respecto a la molécula no glicosilada luego de su inyección subcutánea en ratas, lo cual se manifestó en un incremento de su actividad antitumoral in vivo. El objetivo general del presente trabajo es la obtención de nuevas moléculas hiperglicosiladas de interferón-alfa2b humano recombinante (rhIFN-alfa2b) que presenten propiedades farmacocinéticas mejoradas con respecto a la molécula de IFN-4N, con el fin de aumentar su actividad biológica in vivo y, en consecuencia, su eficacia terapéutica. En particular, se propone la modificación del cDNA del IFN alfa2b humano mediante mutagénesis sitio-dirigida de manera de obtener moléculas con 5 o 6 sitios susceptibles de N glicosilación mediante: i) Mutaciones puntuales de aminoácidos de la molécula de IFN-4N para generar sitios consenso de N-glicosilación, a saber: Asn-Xxx-Ser/Thr; ii) Adición de un péptido portando dos sitios consenso de N-glicosilación en el extremo N-terminal de la molécula de IFN-4N.