Producción, purificación y caracterización de moléculas hiperglicosiladas de rhIFN-alfa2b

GUGLIOTTA, A.; CEAGLIO, N.; OGGERO EBERHARDT, M.; ETCHEVERRIGARAY, M.; KRATJE, R. B.

Rosario. Pcia. Santa Fe. Argentina

Simposio; 1er Simposio Argentino de los Procesos Biotecnológicos (SAProBio 2010); 2010

Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas-Universidad Nacional de Rosario

La producción de proteínas recombinantes de uso terapéutico en células eucariotas constituye una herramienta de gran utilidad ya que ofrece diversas ventajas, entre ellas la capacidad de las mismas de introducir modificaciones post-traduccionales como la glicosilación y de secretar el producto al medio de cultivo, facilitando el proceso de purificación. Los interferones son glicoproteínas sintetizadas por células eucariotas en repuesta a la infección por virus y otros estímulos antigénicos. Constituyen importantes citoquinas del sistema inmune que presentan diversas funciones biológicas: actividad antiviral, antiproliferativa e inmunomoduladora. La formulación no glicosilada del IFN alfa2 producido en bacterias (E. coli) se emplea en el tratamiento de enfermedades virales y patologías tumorales. Sin embargo, su rápida inactivación y eliminación del organismo conduce a la administración de dosis elevadas y frecuentes con el fin de alcanzar la ventana terapéutica, resultando en la aparición de efectos secundarios indeseados. Por este motivo, resulta de gran importancia la generación de variantes del rhIFN-alfa2b con superior actividad biológica in vivo. La aplicación de estrategias de glicoingeniería permite introducir sitios potenciales de N-glicosilación sobre la secuencia de la proteína nativa, generando variantes con una masa molecular superior y, en consecuencia, propiedades farmacocinéticas mejoradas con el concomitante incremento de su eficacia terapéutica. El objetivo de este trabajo consistió en la expresión en células CHO de moléculas de rhIFN alfa2b con un mayor grado de N-glicosilación respecto a la citoquina IFN4N (cuatro sitios de N glicosilación), previamente obtenida en nuestro laboratorio, y su posterior purificación a partir del sobrenadante de cultivo para su caracterización farmacocinética. Particularmente, se aplicaron dos estrategias: i- Modificación puntual de aminoácidos dentro de la secuencia del IFN alfa2b de manera de generar sitios consenso potenciales para N glicosilación (Asn-X-Ser/Thr) y ii Incorporación de un péptido de 9 aminoácidos en el extremo N-terminal de la molécula, el cual porta dos de los sitios mencionados.