IMPACTO DEL SISTEMA DE EXPRESIÓN SOBRE LAS PROPIEDADES DE UNA VARIANTE HIPERGLICOSILADA DE IFN-α

RAUD, BRENDA; GUGLIOTTA, AGUSTINA; OGGERO, MARCOS; CEAGLIO, NATALIA

Santa Fe

Encuentro; XVIII ENCUENTRO DE JÓVENES INVESTIGADORES DE LA UNL; 2014

Universidad Nacional del Litoral

La glicosilación es la modificación co/postraduccional de proteínas más importante que llevan a cabo las células eucariotas y las glicoproteínas representan más de un tercio de los biofármacos aprobados. Trabajos previos han determinado que las glicoproteínas con residuos de ácido siálico terminal presentan una menor tasa de remoción del suero, mayor estabilidad y disminuida inmunogenicidad, por lo que se ha buscado extender el tiempo de vida media en plasma de proteínas terapéuticas mediante glicoingeniería, mejorando así sus propiedades in vivo. En el Laboratorio de Cultivos Celulares se ha desarrollado el IFN4N, un análogo altamente glicosilado del interferón-α2b recombinante humano (rhIFN-α2b) con 4 sitios de N-glicosilación adicionados. Dicha muteína presentó un incremento de su masa molecular y su carga, lo que se manifestó en una sustancial mejora en sus propiedades fármacocinéticas, exhibiendo una vida media plasmática 25 veces superior con respecto al IFN-α2b no glicosilado, y en sus propiedades biológicas, presentando una mayor inhibición del crecimiento in vivo de tumores en ratones inmunocomprometidos. Hasta el momento, el IFN4N ha sido producido en el laboratorio utilizando como huésped la línea celular CHO-K1, de origen murino; no obstante, las células HEK293, de origen humano, son de gran interés para la generación de líneas celulares recombinantes, ya que son fácilmente transfectables y permiten lograr elevados niveles de producción. Estudios previos han demostrado que existen diferencias entre la glicosilación de proteínas obtenidas en células HEK y CHO, particularmente en relación a la cantidad de monosacáridos agregados, la distribución de isoformas y el contenido terminal de ácido siálico. Por otra parte, también se ha reportado que las células CHO, al ser de origen animal, pueden sintetizar componentes glucídicos que son inmunogénicos en seres humanos, tales como el ácido glicolil-neuramínico. Con el fin de analizar el impacto del sistema de expresión sobre la composición y/o estructura de los glúcidos conjugados al IFN4N, dicha citoquina ha sido recientemente expresada en células HEK293T/17, obteniéndose clones estables con una elevada productividad de la misma. Estudios preliminares demostraron diferencias en el perfil de glicosilación del IFN4N respecto al obtenido en células CHO, lo que ha suscitado interés en llevar a cabo una caracterización más exhaustiva de dicha variante, especialmente en cuanto a la identidad y estructura de sus carbohidratos y la influencia de los mismos sobre su farmacocinética in vivo. El objetivo general del presente trabajo consiste en la producción y caracterización del rhIFN-α2b hiperglicosilado (IFN4N) en células HEK293T/17 y su comparación con la misma molécula producida por células CHO-K1, en términos de masa molecular, distribución de isoformas, actividad biológica específica in vitro y estructura de sus carbohidratos.