CHO vs. HEK en la producción de IFN hiperglicosilado

GUGLIOTTA, AGUSTINA; CEAGLIO, NATALIA; PRIETO, CLAUDIO; OGGERO, MARCOS; ETCHEVERRIGARAY, MARINA; KRATJE, RICARDO

Santa Fe

Simposio; V Simposio Latinoamericano de Cultivos Celulares (V SLATCC).; 2012

Laboratorio de Cultivos Celulares. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Universidad Nacional del Litoral

El IFN4N es una muteína del IFN-alfa2b desarrollada en nuestro laboratorio mediante glicoingeniería. Esta molécula presenta una prolongada vida media plasmática con respecto al IFN no glicosilado que se emplea como agente terapéutico debido a su elevado grado de glicosilación, dado por la presencia de cuatro sitios consenso de N-glicosilación. Dichas modificaciones post traduccionales demandan la utilización de células animales como huéspedes para su producción. La línea celular derivada de hámster CHO.K1, constituye uno de los sistemas de producción a gran escala de proteínas recombinantes de uso terapéutico más utilizados, mientras que las células de origen humano HEK 293T han suscitado gran interés para la generación de líneas celulares recombinantes ya que son fácilmente transfectables y permiten lograr elevados niveles de producción de la proteína deseada. En este trabajo se emplearon vectores lentivirales conteniendo la secuencia codificante del IFN4N para transducir células CHO-K1 y HEK293. Las líneas celulares generadas (CHO Td IFN4N y HEK Td IFN4N) fueron sometidas a un proceso de presión selectiva empleando concentraciones crecientes de puromicina, alcanzándose valores del antibiótico de 350 µg/ml para CHO y 200 µg/ml para HEK. Las líneas celulares resultantes del mencionado proceso de selección, evidenciaron un marcado incremento de la productividad específica del IFN4N (8 y 15 veces, respectivamente) con respecto a las líneas no sometidas a dicho procedimiento. Ensayos preliminares para evaluar grado de glicosilación (Western blot) y análisis de la actividad biológica específica in vitro no demostraron diferencias entre las variantes celulares del IFN4N. Finalmente, se llevó a cabo el clonado tales líneas seleccionándose 6 clones a partir de cada una de ellas que fueron caracterizados en función de parámetros de crecimiento y productividad específica, así como también de propiedades fisicoquímicas y biológicas del IFN4N.