Optimización de la producción in vitro de mAbs mediante design of experiments

WANDEL-PETERSEN, V.; KRATJE, R.; OGGERO EBERHARDT, M.; BURGI, MM.

Posadas

Simposio; 6to. Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2021

Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales. Universidad Nacional de Misiones

En nuestro laboratorio, los procesos de purificación y caracterización de rhEPO y de análogos N-hiperglicosilados de la citoquina, requieren del empleo de un anticuerpo monoclonal anti-rhEPO (mAb 2B2) que, hasta el momento, era producido in vivo en líquido ascítico. Debido a preocupaciones éticas, científicas y de seguridad inherentes al uso de animales, se adaptó el hibridoma productor a un medio de cultivo libre de suero fetal bovino (MLS) compuesto por la mezcla 50:50 de los medios comerciales DMEM/Ham’s F12 y EXCELL-620, suplementado con colesterol. El proceso de adaptación consistió en una primera etapa de reducción gradual de la concentración de suero fetal bovino (SFB) en el medio de cultivo, operado en condiciones estáticas, y una segunda etapa de adaptación a MLS en agitación, procedimiento que se realizó mediante un protocolo directo y otro secuencial. Se compararon los cultivos adaptados mediante la determinación de los parámetros específicos: velocidad de crecimiento, velocidad de muerte, productividad y concentración efectiva 50 (CE50) del mAb producido en cada condición. La adaptación directa al MLS mantuvo la tasa de crecimiento y la productividad de la condición inicial; sin embargo, el protocolo secuencial redujo la productividad en un 96%. El clon adaptado a MLS de forma directa fue empleado para la producción del mAb 2B2 en cultivos batch, obteniendo un rendimiento de 200 mg de mAb (concentración promedio 120 μg/ml) con una pureza superior al 98%. Dado el elevado costo de los reactivos que componen el MLS y la necesidad de producir grandes masas del mAb 2B2, se optimizó la formulación del medio de cultivo mediante un diseño de experimentos (DOE) de mezclas D-optimal. El diseño constó de 13 experimentos realizados en un mismo bloque, empleando las siguientes mezclas de los medios DMEM/Ham’s F12:EXCELL-620 50:50, 56:44, 63:37, 75:25, 81:19, 87:13, 94:6, sin el agregado de lípidos. El DOE permitió eliminar el SFB y el colesterol como suplementos nutricionales, arrojando dos soluciones como óptimos simultáneos: las mezclas 67:33 y 94:6 de DMEM/Ham’s F12:EXCELL-620, las cuales establecen una reducción de los costos del medio de cultivo de 10,4 y 40,5 veces, respectivamente, en relación al medio de cultivo inicial. Ambas condiciones lograron mantener la tasa de crecimiento de la condición inicial (valor medio de 0,04 h-1), así como la CE50 e incrementaron la productividad del clon 1,7 y 1,5 veces, respectivamente. En conclusión, la adaptación del hibridoma productor al MLS permitió incrementar 1,3 veces la pureza del mAb, conservar su afinidad aparente y mantener los parámetros de crecimiento y producción. De este modo se reemplazará su producción in vivo por un proceso económico, reproducible, escalable, libre del empleo de animales y de sus derivados, que permitirá disponer del reactivo en grandes cantidades para diferentes propósitos. Como perspectiva futura, se emplearán ambas condiciones óptimas para producir el mAb a mayor escala mediante un proceso bifásico en un biorreactor, en el cual, la mezcla 67:33 se utilizará como medio de cultivo de crecimiento y la mezcla 94:6 como medio de cultivo para perfusión.