Caracterizacion cinetica de intermediarios de la Na,K-ATPasa utilizando la sonda fluorescente RH421 en paralelo a la oclusion de Rb+.

PG. SCHVARTZ; JLE MONTI; RM GONZÁLEZ-LEBRERO; SB. KAUFMAN; PJ GARRAHAN; RC ROSSI

Villa Carlos Paz, Córdoba, Argentina.

Congreso; XXXIV reunión anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB).; 2005

Sociedad Argentina de Biofísica

Introducción La Na,K-ATPasa es una proteína de membrana que acopla el transporte de Na+ y K+ a la hidrólisis de ATP. Dicha hidrólisis se da en ausencia o  presencia de K+ a través de los ciclos denominados Na-ATPasa y Na,K-ATPasa respectivamente (fig 1). En presencia de Na+ y ATP la enzima es capaz de fosforilarse generando el intermediario ocluido E1P(Na3). Luego de un cambio conformacional se liberan de esta especie 3 Na+ al medio extracelular dando lugar a la forma E2P. En ausencia de K+ el ciclo se completa con la desfosforilación que conduce a la enzima a E1 mientras que en  presencia de K+, dos iones se unen a E2P promoviendo una rápida desfosforilación que conlleva la oclusión de los cationes. La desoclusión, acelerada por el ATP, lleva a la enzima a E1.   El objetivo del presente trabajo es estudiar las reacciones parciales del ciclo así como los efectos del K+ en la transición entre la Na-ATPasa y la Na,K-ATPasa. Para ello se realizaron medidas en paralelo de los cursos temporales de oclusión de Rb+, como análogo del K+, y del cambio de fluorescencia de la sonda RH421, que permite detectar E2(Rb2) y E2P. (Sturmer et al. J.Membr.Biol 121(2):141-61, 1991). Resultados Se midieron los cursos temporales completos del cambio de fluorescencia de RH421 al mezclar en un fluorómetro tipo Stopped-Flow diferentes concentraciones de ATP con la enzima en presencia de 150 mM Na+, 0.5 mM Mg2+ y 300 nM RH421 en buffer imidazol 25 mM, pH 7,4 a 25ºC. A partir de estas curvas fue posible calcular la actividad ATPasa, la cual presenta un comportamiento hiperbólico con el sustrato. Luego, se realizaron en paralelo medidas del cambio de fluorescencia de RH421 y de la oclusión de Rb+ mezclando la enzima con diferentes [Rb+] a 6.4 mM ATP.  La actividad ATPasa calculada a partir de estos cursos temporales presenta un comportamiento bifásico con la concentración de Rb+, observándose un máximo a bajas concentraciones del catión. Por otra parte, los niveles de estado estacionario de la fluorescencia de RH421 y del intermediario ocluido presentan  comportamientos sigmoideos con [Rb+]. Las tres propiedades, actividad ATPasa, nivel de estado estacionario de RH421 y nivel de estado estacionario de los intermediarios ocluidos, pueden ajustarse a un  cociente de polinomios de segundo grado con idéntico denominador, condición necesaria para que representen el mismo fenómeno.   Conclusiones El ajuste de un modelo de reacción a los datos experimentales fue posible gracias a la incorporación  de los efectos de los productos de reacción sobre el ciclo catalítico, siendo el más importante el efecto competitivo del ADP con el ATP en el sitio de alta afinidad, y al efecto acelerador de la catálisis producido por la unión de un Rb+. El ajuste permitió verificar que la unión del primer Rb+ acelera la velocidad de desfosforilación sin aparentemente transportarse (Sachs et al. J. Clin. Invest. 46:61-76, 1967)  mientras que la unión del segundo Rb+ es la que produce la transición entre la Na-ATPasa y la Na,K-ATPasa. También se pudieron obtener valores precisos de las constantes de velocidad de los pasos intermedios de reacción descartando al cambio conformacional E1P -> E2P como paso limitante. Con subsidios de: ANPCYT, CONICET y UBACYT.