Evidencias de un estado ocluido en la PMCA.

MC DE LA FUENTE; RM GONZÁLEZ-LEBRERO; M SAMSA; RC ROSSI; JPFC ROSSI

Villa Carlos Paz, Córdoba, Argentina.

Congreso; XXXIV reunión anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB).; 2005

Sociedad Argentina de Biofísica

Las bombas de Ca2+ de membrana plasmática (PMCAs), se distribuyen ampliamente en diversos tejidos. La PMCA es una P-ATPasa codificada por una familia multigénica. Las isoenzimas 1 y 4 se transcriben en la mayoría de los tejidos, mientras que 2 y 3 se expresan en tejidos excitables. Otras isoformas se generan por empalme alternativo, alterando la afinidad por calcio, calmodulina, fosfolípidos y ATP. Durante su ciclo de reacción las P-ATPasas dan lugar a la formación de intermediarios fosforilados estables en medio ácido (EP), cuya concentración es medida al incubar PMCA con [g-32P]ATP y detener la reacción por desnaturalización en medio ácido. Para el proceso de transporte, se postula que el Ca2+ es captado en el lado citoplasmático de la enzima cuando ésta se encuentra en la conformación E1 y liberado durante la transición E1P ® E2P. La reacción de fosforilación sería concomitante con la desaparición transitoria del catión dentro del dominio transmembrana de la enzima, en el confórmero E1P, fenómeno que se denomina oclusión. En ese momento, el Ca2+ es inaccesible al medio que baña ambas caras de la membrana. Sin embargo dificultades metodológicas impidieron determinar este fenómeno en PMCA. El objetivo de este trabajo fue verificar y caracterizar estados ocluídos de Ca2+ de la PMCA. Para ello implementamos un método utilizando PMCA que proviene de preparaciones microsomales a partir de su expresión transitoria en células Sf21 utilizando un Baculovirus. La medida de Ca2+ captado por los microsomas se llevó a cabo por el método de Rossi y col. (Anal. Biochem. 270: 276-285, 1999.). La mezcla reactiva que contiene PMCA y ATP a 25ºC se mezcla con (45Ca)Ca2+ y se inyecta dentro de una cámara de filtrado por donde fluye una solución de lavado fría (2ºC). La reacción se detiene por un abrupto descenso de temperatura y dilución de la enzima que es retenida y lavada sobre un filtro Millipore de 0.6 micrones. Luego se cuantifica el 45Ca2+ midiendo la radioactividad retenida sobre el filtro. Los resultados obtenidos muestran que se detecta una oclusión de calcio: (1) proporcional a la actividad específica de la enzima, (2) que se evidencia mejor en presencia de La III, un inhibidor del transporte que bloquea el cambio conformacional E1P → E2P (3) el intermediario ocluido va desde 0.0044 a 0.61 nmol de 45Ca2+/mg proteína en función de la concentración de La III. Experimentos controles muestran que en las condiciones que se obtiene el máximo de oclusión ocurre una captación por transporte activo de calcio del orden de 0.9 nanomol/mg proteína/hora. Los resultados obtenidos son consistentes con que el sistema de medida utilizado permitiría la caracterización de estados ocluidos de calcio en la PMCA. Con subsidios de NIH, Fogarty International Center Grant R03TW006837, ANPCYT, CONICET y UBACYT