CARACTERIZACIÓN CINÉTICA Y ESTRUCTURAL DE COMPONENTES DEL SISTEMA TIORREDOXINA EN ESPECIES PATÓGENAS Y SAPRÓFITAS DE Leptospiras.

SASONI, NATALIA; ARIAS, DIEGO G.; IGLESIAS, ALBERTO A.; GUERRERO, SERGIO A.

Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología; 2013

El género Leptospira contiene especies patogénicas (L. interrrogans) y saprófitas (L.biflexa,), que difieren en su capacidad de sobrevivir en diferentes ambientes. Aproximadamente, dos tercios de los genes en L.interrogans tienen sus ortólogos en L.biflexa, esto es consistente con un origen evolutivo común, mientras que genes que son únicos en L.interrogans se presume que codifican para proteínas asociadas a la virulencia. El sistema tiorredoxina de L.interrogans, está compuesto por LinTrxR (tiorredoxinareductasa), una TrxR de bajo peso molecular que cataliza la reducción dependiente de NADPH de la LinTrx (tiorredoxina). Esta última, a través de sus residuos decisteínas es capaz de reducir los enlaces disulfuros de proteínas sustrato oxidadas. La presencia de dos genes codificantes para tiorredoxina reductasas en L.biflexa plantea un interrogante acerca de la importancia de esas proteínas para ambas especies.Objetivo. Estudio cinético y estructural delsistema tiorredoxina en L. interrogans y en L.biflexa. Metodologías: Cultivo de Leptospiras. Se hizo en EMJH a 28º C, pH: 7,4, durante 7 días. Obtención de las proteínas recombinantes. Las secuencias codificantes de las proteínas se amplificaron por PCR a partir del DNA genómico de las bacterias y con oligonucleótidos específicamente diseñados. Se expresaron empleandopET28 c, en E. coli BL21 (DE3) y se purificaron por IMAC. Ensayos cinéticos y caracterización estructural. Se siguió la metodología descripta por D.G. Arias et al 2007, 2008 y 2012.Resultados. LinTrxR y LbiTrxR1 son homodímeros que presentan FAD como grupo prostético y son específicas para NADPH (como cofactor reducido). No presentan actividad disulfuro reductasa con GSSG, lipoamida, ni cistina como sustratos directos. Ambas son capaces de reducir DTNB, K3Fe(CN)6 y benzoquinona a expensas de NADPH. Estas reductasasson específicas para Trx de leptospira; no siendo capaces de emplear Trxs heterólogas como sustratos. Algunos compuestos inorgánicos, como el Hg+2 y otros orgánicos, como el azul de metileno, son inhibidores potentes de la actividad disulfuro reductasa del sistema tiorredoxina, así como del crecimiento de las bacterias. De forma similar a las otras enzimas, LbiTrxR2 esun homodímero que presenta FAD como grupo prostético, pero no es capaz de emplear NADPH ni NADH como cofactor. Hasta el momento, no pudimos demostrar su capacidad reductora frente a LinTrx. Conclusión. LbiTrxR1 y LinTrxR no presentaron diferencias estructurales y funcionales in vitro. Continuaremos el trabajo de caracterización de estas enzimas a nivel molecular y celular con el fin de conocer la relevancia de las mismas en la fisiología de estas bacterias y en la patogenicidad de L.interrogans. Asimismo seguiremos evaluando la funcionalidad de LbiTrxR2.