Desarrollo de un complejo de nanopartículas de Quitosano-ARN como alternativa para el manejo de patógenos fúngicos en el cultivo orgánico de hortalizas

DIB, NAHIR ; FALCONE, DARIO; ARIEL, FEDERICO; RODRÍGUEZ MELO, JOHAN

Encuentro; Encuentro de Superficies y Materiales Nanoestructurados; 2022

Numerosos trabajos han demostrado que al aplicar ARNs de manera exógena a las plantas, estas soncapaces de absorberlos en sus células. En el caso de los ARNs doble cadena (ARNdcs), la maquinaria endógenade biogénesis de pequeños ARNs (pARNs) es capaz de procesar los precursores y generar moléculas conactividad de silenciamiento contra transcriptos endógenos o de patógenos, según el diseño del ARNdc [1, 2].Sin embargo, mediante la aplicación en solución acuosa, los ARNs libres exhiben una baja permanencia a causade su inestabilidad, limitando su eficacia. Con el objetivo de desarrollar NPs como estabilizantes de lasmoléculas de ARNdc, se propuso la síntesis de nanopartículas de quitosano (NPs-Q) asociadas a un ARNdc(sintetizado in vitro) contra el hongo Botrytis cinerea (Patógeno de varios cultivos de interés agronómico).Deeste modo, se pretende generar una formulación alternativa al uso excesivo de agroquímicos, que sirva comometodología para el control de plagas en cultivos de hortalizas.En una primera etapa, se sintetizaron NPs-Q a través del método de gelificación iónica, utilizandotripolifosfato de sodio (TPP) como entrecruzador. Se evaluaron diferentes parámetros experimentales comoconcentración de reactivos (0.1% p/v y 0.05 % p/v), tiempo de reacción, relación Q:TPP (1:1, 3:1 y 6:1) y pH(2.8, 4.6 y 5.5) de manera de generar NPs de tamaños del orden de 200-300 nm de diámetro y bajapolidispersidad (0.1-0.3). La formación, tamaño, polidispersidad y estabilidad en el tiempo de las NPs-Q sedeterminó mediante dispersión dinámica de luz (DLS).En la segunda etapa se evaluó la formación del complejo de NPs Q+ARNdc. Para esto se utilizaron 3metodologías: A) adición de solución de TPP-ARN a la solución de Q. B) adición de ARN a la solución de Q (elARN actúa como entrecruzador). C) adición de ARN a las NPs de Q:TPP previamente formadas. Los resultadospermitieron determinar que la metodología C es la más adecuadas para la formación del complejo NPs-QARNdc, permitiendo obtener NPs de baja polidispersidad y de tamaño nanométrico similar a las NPs-Q sinARNdc. Posteriormente en una tercera etapa, se estudió la capacidad de las NPs-Q de incorporar el ARNdc,sembrando en gel de agarosa y evaluando las diferencias en la migración. Además, se cuantificó medianteespectroscopía UV la cantidad de ARN adsorbido y libre en función de la concentración de NPs-Q y el tiempode incubación. Por último, se cuantificó el porcentaje de ARN liberado desde el complejo NPs-Q-ARNdc. Paraesto, se incubaron los complejos en una solución de PBS a pH 7.4 y se tomaron medidas a 1, 24, 48 y 72 horas.Los resultados obtenidos permitieron determinar la formación casi inmediata del complejo NPs-Q-ARN. Y unaposterior liberación del ARN hasta las 48 horas post incubación en PBS.En conclusión, la formulación propuesta en este trabajo para el desarrollo del complejo de NPs-QARNdc resultó ser efectiva. La eficiencia en la adsorción y liberación gradual y sostenida del ARNdc de las NPsde Q permitirían la incorporación de estas moléculas a la planta y/o al organismo patógeno target. Ensayosfuturos utilizando este complejo de NPs-Q-ARNdc contra el patógeno B. cinerea permitirán determinar laeficacia del mismo para el control de este y otros patógenos en el cultivo de hortalizas.