Clonado molecular, expresión heteróloga y purificación de una posible Tiorredoxina reductasa de Babesia bovis.

ERIKA LUCÍA REGNER; DIEGO G. ARIAS; CAROLINA THOMPSON; IGNACIO ECHAIDE; ALBERTO A. IGLESIAS; SERGIO A. GUERRERO

Encuentro; SAP XXIV Reunión Anual.; 2010

Babesia bovis es un coccidio causante de la babesiosis bovina. Esta enfermedad es enzoótica en áreas tropicales y subtropicales y causa grandes pérdidas económicas en la industria ganadera. Las especies presentes en Argentina son Babesia bovis y B. bigemina, las cuales son transmitidas por la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus. En este trabajo, se propuso estudiar la tiorredoxina reductasa (TRXR), uno de los componentes del sistema de control del balance redox intracelular del parásito, crucial para la supervivencia y virulencia del parásito, ya que es capaz de determinar y regular varias funciones celulares. La TRXR es un componente crítico en la respuesta frente al estrés oxidativo al que está expuesto el parásito que en la fase eritrocítica vive en un ambiente muy rico en oxígeno. La TRXR es una flavoenzima que cataliza la reducción de tiorredoxina en una reacción dependiente de NADPH. En base a un análisis in sílico que realizamos se concluyó que esta enzima pertenece a la familia piridina nucleótido disulfuro oxidoreductasa de alto peso molecular (H-TRXR). Mediante el análisis en bases de datos y por homología con secuencias ortólogas de otras H-TRXR informadas se identificó la secuencia peptídica de la enzima y se realizó la síntesis química del gen que codifica para la misma. Con el objeto de obtener la enzima TRXR en forma recombinante se clonó la secuencia codificante de la misma y se expresó utilizando el vector de expresión pRSET-A en células E. coli BL21 (DE3). La proteína recombinante (BbTRXR) se expresó mayormente en forma insoluble, sin embargo, se logró obtener aceptables niveles de expresión en la fracción soluble, a partir de la cual se purificó en una columna de agarosa-NTA-Ni2+. La funcionalidad de BbTRXR como disulfuro reductasa se evaluó por medio de la capacidad de reducción del sustrato disulfuro modelo para las TRXR, el DTNB, en presencia de NADPH o NADH, como dadores de equivalentes de reducción. La actividad DTNB reductasa fue ensayada por seguimiento de la generación de TNB, monitoreando la absorbancia a 405 nm. Sólo se detectó actividad disulfuro reductasa en presencia de NADPH. Además, se determinó que la enzima no presenta actividad NAD(P)H oxidasa ni de glutatión reductasa. Estos estudios, amplían el conocimiento sobre macromoléculas que, en B. bovis, podrían ser relevantes para el normal funcionamiento celular, ya que la función primaria de estos sistemas es el mantenimiento de la homeostasis redox intracelular. Trabajo realizado con fondos del proyecto PICT 2007 668.