Validación de una dúplex-PCR para la identificación de Pseudomonas aeruginosas y detección temprana de blavim-2 en muestras de esputo de pacientes con Fibrosis Quística

CASTAÑEDA NC, MERKIER AK, PASTERÁN F, QUIROGA MP, JORDÁ VARGAS L, GALANTERNICK L, PROCOPIO A, PIVETTA O, VÁZQUEZ M, CENTRÓN D.

Congreso; II Congreso Argentino de Fibrosis Quística; 2012

INTRODUCCIÓN: Pseudomonas aeruginosa es el principal patógeno del tracto respiratorio implicado en la declinación de la función pulmonar en los pacientes con fibrosis quística (FQ). La detección precisa de P. aeruginosa a partir de muestras de esputo mediante dúplex-PCR y la detección de los mecanismos implicados en la resistencia a los antibióticos son importantes herramientas epidemiológicas para determinar el tratamiento antibiótico y así colaborar con la calidad de vida de estos pacientes. OBJETIVOS: El objetivo de este trabajo fue validar y evaluar la dúplex-PCR para la identificación de P. aeruginosa y detectar carbapenemasas directamente de muestras de esputo con el fin de mejorar la detección de dichas resistencias en P.aeruginosa MATERIALES Y MÉTODOS : Se validó la metodología molecular de dúplex-PCR a partir de 15 muestras previamente identificadas en un laboratorio de referencia y con PA01. También se realizó una caracterización genotípica y fenotípica prospectiva de la resistencia a los antibióticos β-lactámicos en 60 aislamientos de P. aeruginosa a partir de 18 pacientes con FQ, 11 de Argentina y 7 de Brasil. Se evaluó la robustez y resistencia utilizando 2 diferentes cicladoras de PCR (resistencia), y diferentes lotes de reactivos y temperaturas de apareamiento/extensión (robustez) para determinar las características más críticas para la transferencia del ensayo inter e intra-laboratorio. RESULTADOS: Se trabajó con 15 muestras de prueba-control procedentes de pacientes con FQ y la cepa de referencia PAO1 y posteriormente se validó la metodología analizando rango de trabajo, selectividad y robustez. Con respecto al rango de trabajo, los valores máximos y mínimos obtenidos fueron en el orden de 109 a 103 UFC/50µl. Y el límite de corte del ADN para las mismas muestra fue de 2.8x105 UFC/50µl y el límite de detección fue de 5x104 UFC/50μl. En la determinación de inclusividad todas las muestras estudiadas presentaron señal positiva al utilizar el ADN en concentraciones de 104 UFC/50ul de mezcla de reacción de PCR. Cuando se pusieron a prueba la exclusividad de los cebadores, las cepas no pertenecientes a P. aeruginosa no amplificaron los genes oprL ni ETA. La dúplex-PCR para la identificación de P. aeruginosa mostró una sensibilidad del 96%, una especificidad del 87%, valor predictivo positivo del 87%, y valor predictivo negativo del 94% cuando se analizaron las 16 muestras de la validación. La secuencia de los productos de PCR con cebadores para varias carbapenemasas (genes tipo blaIMP, genes tipo blaVIM, genes tipo blaGES y blaSPM-1a partir de esputo, reveló la presencia de blaVIM-2 en 3 de las 5 muestras de esputo del paciente CF1 de Argentina. Por otro lado, un total de 14 aislamientos, que pertenecían a 5 pacientes (CF1, CF4, CF8, CF9 y CF10), mostraron resistencia a ambos carbapenemes. Seis de estas cepas que poseían un mecanismo enzimático provenían del mismo paciente CF1 y pertenecían a un mismo clon, según análisis de PFGE, que se mantuvieron en el paciente a lo largo de 2 años que duró nuestro estudio. Conclusiones: -Sé validó la metodología de dúplex-PCR de los genes oprL y ETA para la identificación de P.aeruginosa y su uso en laboratorio a partir de muestras respiratorias, donde cumplimentó con los parámetros de rango de trabajo, selectividad y robustez. Y se obtuvo resultados óptimos para su desarrollo y aplicación como ?metodología desarrollada en un laboratorio?. -La técnica de PCR cumplimentó los siguientes parámetros: 87% de especificidad, 96% de sensibilidad, 87% valor predictivo positivo, 94% valor predictivo negativo. - Por dúplex-PCR se logró exitosamente la identificación de Pseudomonas aeruginosa partir de las muestras respiratorias con alta especificidad y sensibilidad. -La detección precoz de blaVIM-2 directamente de muestras de esputo nos advirtió de la presencia de una cepa resistente a carbepenemes en P. aeruginosa, la cual 48hs más tarde también fue evidenciada por métodos fenotípicos. Además, esta rápida técnica de identificación basada en una dúplex-PCR también nos llevó a conseguir un tratamiento eficaz y evitar la transmisión entre los pacientes con FQ.