OPTIMIZACIÓN DE LA TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE LA CAÑA DE AZÚCAR Y OBTENCIÓNDE GENOTIPOS TOLERANTES A HERBICIDAS EN LA ESTACIÓN EXPERIMENTAL AGROINDUSTRIAL OBISPO COLOMBRES (EEAOC).

NOGUERA, ALDO SERGIO; RACEDO, JOSEFINA; FILIPPONE, MARÍA PAULA Y CASTAGNARO, ATILIO PEDRO.

San Miguel de Tucumán, Tucumán, Argentina.

Congreso; XV Reunión Técnica Nacional de la Caña de Azúcar; 2008

Las plantas cultivadas han sido manipuladas genéticamente por el hombre desde hace siglos a través de ciclos de cruzamiento y selección, lo que se conoce como mejoramiento convencional (o clásico). Este es un proceso lento y laborioso que puede tardar entre 5 y 11 años, según el cultivo, y para el cual es indispensable contar con variabilidad genética seleccionable. Uno de los principales problemas de esta aproximación es que cuando se persigue un carácter, aunque éste esté controlado por uno o pocos genes, en cada ciclo nunca se selecciona a un solo gen sino a un grupo entre los cuales puede haber genes indeseables. Sumado a esto, en algunos casos, las características de interés no se encuentran en el germoplasma cultivado ni en el directamente emparentado lo que imposibilita su transferencia por vía sexual. El reciente desarrollo de métodos no sexuales para transferir genes, como la transformación genética directa, permite superar estas limitaciones convirtiéndose en una herramienta valiosa para la mejora vegetal. Sin embargo, esta tecnología solo sirve para transferir una o pocas características a una variedad ya mejorada. Existen distintos métodos para transformar plantas cuya elección depende de la especie, del material vegetal, de la capacidad de regeneración y de la eficiencia de transformación. La técnica de biobalística (Sanford, J.C. et al (1987). Particle Sci. Tech. 5:2737 .) ha sido empleada con muy buenos resultados en una gran variedad de especies vegetales incluída la caña de azúcar. Dicho método involucra un proceso en el cual micropartículas recubiertas con DNA son aceleradas por un gas comprimido e introducidas en células vegetales de un tejido indiferenciado llamado callo. La Sección Biotecnología de la EEAOC trabaja desde el año 2006 en la transformación genética de caña de azúcar con la finalidad de introducir genes de interés agronómico en las variedades comerciales locales RA 87-3 y TUC 77-42. A fin de evaluar la eficiencia de la técnica de biobalística, se realizaron ensayos de expresión de un gen reportero (uidA) que permite detectar visualmente la incorporación del mismo en el genoma de las células vegetales. Esto permitió ajustar los parámetros involucrados y optimizar el proceso de transformación de tejido calloso con el gen de interés, como así también optimizar la regeneración de plantas a partir de callos embriogénicos. Para la obtención de los callos embriogénicos utilizados como explantes, se cultivaron “in vitro” discos de ápice caulinar de caña de azúcar. Una vez obtenidos, los callos fueron bombardeados con partículas de tungsteno recubiertas con un segmento lineal de DNA plasmídico (moléculas de DNA circular) que lleva el gen de interés EPSPs, el cual codifica para una enzima que otorga tolerancia al herbicida glifosato. El fragmento plasmídico cuenta además con el gen NPTII que proporciona resistencia al antibiótico geneticina, lo que permite seleccionar “in vitro” las células transformadas. Hasta el momento se bombardearon aproximadamente 7000 porciones de callos entre las dos variedades citadas, a partir de los cuales se seleccionaron y regeneraron en medio de cultivo suplementado con geneticina, 107 eventos de transformación. Actualmente las líneas transgénicas provenientes de cada uno de estos eventos se encuentran en etapa de aclimatación en invernadero acorde a la normativa de la Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA; Exp Nº S01 -0231880/2007). La presencia del transgén en cada evento fue evaluada mediante la técnica PCR (del inglés “Polymerase Chain Reaction”) utilizando cebadores específicos. Los niveles de tolerancia conferidos por la expresión del transgen fueron evaluados fenotípicamente con diferentes dosis del herbicida glifosato, mientras que la correlación de la tolerancia con el nivel de expresión del trasngén en cada evento será caracterizada por ensayos de “northern” y/o RT-PCR (del inglés “retrotranscription”– PCR).uidA) que permite detectar visualmente la incorporación del mismo en el genoma de las células vegetales. Esto permitió ajustar los parámetros involucrados y optimizar el proceso de transformación de tejido calloso con el gen de interés, como así también optimizar la regeneración de plantas a partir de callos embriogénicos. Para la obtención de los callos embriogénicos utilizados como explantes, se cultivaron “in vitro” discos de ápice caulinar de caña de azúcar. Una vez obtenidos, los callos fueron bombardeados con partículas de tungsteno recubiertas con un segmento lineal de DNA plasmídico (moléculas de DNA circular) que lleva el gen de interés EPSPs, el cual codifica para una enzima que otorga tolerancia al herbicida glifosato. El fragmento plasmídico cuenta además con el gen NPTII que proporciona resistencia al antibiótico geneticina, lo que permite seleccionar “in vitro” las células transformadas. Hasta el momento se bombardearon aproximadamente 7000 porciones de callos entre las dos variedades citadas, a partir de los cuales se seleccionaron y regeneraron en medio de cultivo suplementado con geneticina, 107 eventos de transformación. Actualmente las líneas transgénicas provenientes de cada uno de estos eventos se encuentran en etapa de aclimatación en invernadero acorde a la normativa de la Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA; Exp Nº S01 -0231880/2007). La presencia del transgén en cada evento fue evaluada mediante la técnica PCR (del inglés “Polymerase Chain Reaction”) utilizando cebadores específicos. Los niveles de tolerancia conferidos por la expresión del transgen fueron evaluados fenotípicamente con diferentes dosis del herbicida glifosato, mientras que la correlación de la tolerancia con el nivel de expresión del trasngén en cada evento será caracterizada por ensayos de “northern” y/o RT-PCR (del inglés “retrotranscription”– PCR).EPSPs, el cual codifica para una enzima que otorga tolerancia al herbicida glifosato. El fragmento plasmídico cuenta además con el gen NPTII que proporciona resistencia al antibiótico geneticina, lo que permite seleccionar “in vitro” las células transformadas. Hasta el momento se bombardearon aproximadamente 7000 porciones de callos entre las dos variedades citadas, a partir de los cuales se seleccionaron y regeneraron en medio de cultivo suplementado con geneticina, 107 eventos de transformación. Actualmente las líneas transgénicas provenientes de cada uno de estos eventos se encuentran en etapa de aclimatación en invernadero acorde a la normativa de la Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA; Exp Nº S01 -0231880/2007). La presencia del transgén en cada evento fue evaluada mediante la técnica PCR (del inglés “Polymerase Chain Reaction”) utilizando cebadores específicos. Los niveles de tolerancia conferidos por la expresión del transgen fueron evaluados fenotípicamente con diferentes dosis del herbicida glifosato, mientras que la correlación de la tolerancia con el nivel de expresión del trasngén en cada evento será caracterizada por ensayos de “northern” y/o RT-PCR (del inglés “retrotranscription”– PCR).NPTII que proporciona resistencia al antibiótico geneticina, lo que permite seleccionar “in vitro” las células transformadas. Hasta el momento se bombardearon aproximadamente 7000 porciones de callos entre las dos variedades citadas, a partir de los cuales se seleccionaron y regeneraron en medio de cultivo suplementado con geneticina, 107 eventos de transformación. Actualmente las líneas transgénicas provenientes de cada uno de estos eventos se encuentran en etapa de aclimatación en invernadero acorde a la normativa de la Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA; Exp Nº S01 -0231880/2007). La presencia del transgén en cada evento fue evaluada mediante la técnica PCR (del inglés “Polymerase Chain Reaction”) utilizando cebadores específicos. Los niveles de tolerancia conferidos por la expresión del transgen fueron evaluados fenotípicamente con diferentes dosis del herbicida glifosato, mientras que la correlación de la tolerancia con el nivel de expresión del trasngén en cada evento será caracterizada por ensayos de “northern” y/o RT-PCR (del inglés “retrotranscription”– PCR).